茶樹炭疽菌的鑒定及致病力分析

劉 威,葉乃興,劉 偉,金 珊,連玲麗,賴建東,謝運海

(1.福建農林大學園藝學院/茶學福建省高等學校重點實驗室 ,福建福州350002；2.信陽農林學院茶學院 ,河南信陽464000；3.福建農林大學茶葉科技與經濟研究所；4.福建農林大學生命科學學院 ,福建福州350002)

茶樹炭疽菌的鑒定及致病力分析

劉 威1 ,2,葉乃興1 ,3,劉 偉3,金 珊1 ,3,連玲麗4,賴建東1,謝運海1

(1.福建農林大學園藝學院/茶學福建省高等學校重點實驗室 ,福建福州350002；2.信陽農林學院茶學院 ,河南信陽464000；3.福建農林大學茶葉科技與經濟研究所；4.福建農林大學生命科學學院 ,福建福州350002)

通過PCR擴增并測定福建省不同產地茶樹上分離的炭疽病菌的β-Tub2、ITS、GDPH和ACT 4段基因序列 ,采用多基因系統發育分析 ,結合其純培養、分生孢子、附著孢等形態特征對分離菌進行鑒定 ,并采用離體法測定菌株的致病力.結果表明:5株供試病原菌分離物均為Gloeosporium cingulata f.sp.camelliae ,為茶樹炭疽病病原菌 ,它們的培養性狀和形態特征都相似.致病力測定表明 ,所有分離物均對茶樹葉片致病 ,但其中一株致病力明顯強于其余菌株 ,且致病力強的菌株與其余菌株的基因序列存在差異.

茶樹；炭疽菌；病原鑒定；強致病力；多基因系統發育

炭疽病是一種真菌侵染引起的植物病害 ,在世界各茶區茶樹上均有發生.茶樹是我國南方重要的經濟作物之一 ,炭疽病的發生給部分茶區帶來較大損失 ,其可造成茶樹樹勢衰落、茶葉產量與品質降低.炭疽病致病菌種類繁多 ,不同種之間生物學特性存在差異 ,因此鑒定該病的病原菌是病害防治的首要問題.Miy-ake[1]將在日本茶樹上發現的炭疽病菌鑒定為Gloeosporium theae-sinensis；魏景超[2]報道該種病原菌可侵染我國茶樹并引起炭疽病.國內外已報道能侵染茶樹的炭疽病致病菌有Colletotrichum camelliae、C.gloeospori-oide、C.crassipes等[3－5].劉威等[6－7]在福建茶樹上發現和證實C.fructicola與C.gloeosporioide可侵染茶樹并引起炭疽病 ,為茶樹炭疽病的病原菌.同一地區不同炭疽菌種的致病力存在一定差異 ,不同地區同一炭疽菌種的致病力也存在一定差異[8].我國對茶樹炭疽病病原菌的鑒定多以形態特征和癥狀為依據 ,較少采用多基因系統發育分析進行鑒定.而形態特征不僅易受環境影響 ,而且一些不同種炭疽菌形態差異并不明顯 ,因此將分子生物學技術與形態學結合使研究結論更加可靠[9－10].本研究在對我國南部幾個地區茶樹炭疽菌進行分離培養、致病性測定時 ,發現5株致病力相對較強的炭疽菌株 ,采用分子生物學和形態學相結合的方法對其進行鑒定 ,并測定其致病力 ,以期為茶樹炭疽病的綜合防治及抗病育種提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 供試菌株

于2012年6－9月分別從福建省福州市、寧德周寧縣、泉州安溪縣和永春縣4個地區采集不同茶樹品種炭疽病典型病葉標本 ,利用組織分離法從病葉上分離病原菌 ,經單孢分離獲得純培養菌株 ,編號為ZRG、YFS、ZHD、ABS和FHG的5株炭疽菌株 ,并通過接種測定確認為茶樹炭疽病致病菌.以上各菌株均用PSA培養基保存在4－8℃冰箱內備用.

1.2 純培養與形態性狀

借鑒劉威等[6]的方法進行各菌株純培養特征、菌落生長速度、分生孢子和附著孢形態和大小等的研究.菌株命名參考文獻[11－16].

1.3 致病力測定

采用Koch′S法[17]離體測定致病力.將分離到的病原菌在PSA平板培養基上培養直至產孢 ,加無菌水制成孢子懸浮液 ,用孢子懸浮液對茶樹葉片進行有傷口接種和無傷口接種.具體方法:選取成熟葉片 ,清水洗滌干凈 ,在超凈工作臺中用5%次氯酸鈉溶液浸泡1 min ,75%酒精浸泡3 min ,無菌水清洗3次后自然風干 ,備用.每片葉脈兩側各設3個點 ,共4個有傷口接種點、1個無傷口接種和1個有傷口接種無菌水(CK) ,每個菌株3次重復.將接種葉片置于26℃、濕度為95%、12 h光暗交替的人工氣候箱中培養 ,每隔1－2 d觀察癥狀 ,測量并記錄第8天的病斑直徑 ,描述病斑特點并拍照.

1.4 菌絲DNA的提取與PCR擴增

將供試菌株分別接種到液體培養基中培養并收集菌絲 ,液氮研磨后參考Chen et al[18]的方法提取菌絲體基因組DNA.采用引物Bt2a/Bt2b[19]、ITS1/ITS4[20]、GDF/GDR[21]、ACTF/ACTR[21]對菌株的DNA進行PCR擴增 ,分別獲得β-Tub2、rDNA-ITS、GPDH和ACT等4段基因.ITS基因PCR擴增反應體系及組分: 50 μL反應體系 ,其中10×PCR緩沖液(含Mg2＋)5 μL、dNTP 4 μL、上下游引物各1 μL(10 μmol?L－1)、rTaq DNA聚合酶0.5 μL、DNA模板為5 ng ,ddH2O 38.5 μL.PCR反應程序:94℃預變性4 min；94℃50 s、55℃50 s、72℃1 min ,共30個循環；最后72℃延伸10 min.其余3段基因PCR反應體系及反應程序除退火溫度外與ITS基因相同.反應結束后取5 μL PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.5 PCR產物的純化、克隆和測序

利用DNA回收純化試劑盒(大連寶生物工程有限公司)回收PCR擴增產物 ,回收后的DNA經PM-Dl8-T vector連接后轉化到大腸桿菌DH5a感受態細胞中 ,經藍白斑篩選和菌落PCR鑒定陽性轉化子 ,穿刺接種后 ,送往上海華大基因科技有限公司進行堿基測序.測序所得的各菌株各段基因序列上傳到NCBI (http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)的GenBank中 ,獲得20個登錄號(表1).

1.6 多基因系統發育樹的構建

將供試菌株各基因序列首尾相連 ,連接順序為β-Tub2—ITS—GPDH—ACT.從GenBank數據庫中下載相關炭疽菌β-Tub2、ITS、GPDH和ACT基因序列作為參考序列(表1) ,以相同的方法將各基因首尾相連.采用Mega 5.1軟件鄰近(neighbor-joining ,NJ)法構建系統發育樹 ,以自展法(bootstrap)進行檢測 ,共循環1000次.

2 結果與分析

2.1 致病性及致病力測驗結果

2.1.1 菌株致病性測驗結果 致病性測驗結果顯示 ,有傷口的茶樹葉片分別接種ZRG、YFS等5株供試菌后 ,均能觀察到病斑(圖1).將病斑組織分別用PSA培養基重新分離和培養 ,獲得與原接種菌株一致的菌落 ,產生的分生孢子與原接種菌株形態特征一致.無傷口接種和有傷口接種無菌水(CK)處理均未發現病斑(圖1) ,對接種處組織進行分離 ,未見菌落生長 ,說明供試菌株僅能從傷口侵染茶樹葉片.上述接種測驗步驟符合Koch′S法則 ,表明供試菌是茶樹炭疽病的病原菌.

表1 從GenBank下載的供試基因序列1)Table 1 Sequences obtained from GenBank used in the analysis

圖1 接種ZRG和YFS菌后的茶樹葉片病斑特點Fig.1 Symptoms of tea plant leaves inoculated ZRG and YFS Colletotrichum

2.1.2 菌株致病力測驗結果 茶樹葉片室內接種5株菌3 d后 ,均在葉片接種部位開始發病 ,病斑近似圓形 ,逐漸擴展 ,病斑處呈褐色.10 d后葉片表面開始著生膠質狀的橘紅色分生孢子團.病斑直徑測量(第8天)結果顯示 ,接種菌株ZRG的病斑直徑最大 ,為10－15 mm ,而接種其他4株菌的病斑直徑為3－7 mm ,說明菌株ZRG的致病力強于其余4株菌(圖1).

2.2 茶樹炭疽菌形態特征

供試5株菌感染茶樹葉片的特征相似 ,病斑淺灰色 ,凹陷 ,呈半葉型 ,病斑處薄且易破碎(圖2A、B).分生孢子盤寄生于茶葉表皮下 ,后期穿破表皮形成無色分生孢子 ,有剛毛(圖2G) ,剛毛褐色 ,有隔.

圖2 茶樹炭疽菌形態特征Fig.2 Morphological characteristics of G.cingulata f.sp.camelliae

供試5株菌在PSA培養基上的純培養特征相似 ,在26℃、黑暗條件下培養 ,生長速度為1.06－1.34 cm?d－1,菌落白色、灰白色 ,隆起(圖2C) ,氣生菌絲發達 ,邊緣較整齊；背面土色、黑色 ,像有黑色素沉積.分生孢子堆淺黃色或粉紅色 ,分生孢子長橢圓、橢圓形 ,部分為花生形 ,頂端鈍圓 ,表面粗糙 ,有黑色顆粒；無色 ,2－3個油球；(12.5－17.5)×(2.5－7.5)μm(圖2D).分生孢子附著孢梨形、不規則形；邊緣黑色 ,表面黑色顆粒明顯 ,(5.5－15.0)×(5.0－9.5)μm(圖2E、F).依據病原菌的培養性狀和形態特征 ,參照文獻[16－18]的描述 ,初步將供試5株茶樹炭疽病病原菌鑒定為G.cingulata f.sp.camelliae.

2.3 炭疽菌的分子鑒定

多基因系統發育分析結果(圖3)顯示 ,5株寄主為茶樹的炭疽菌與C1291、ICMP10646 2個菌株以較高的支持率聚在類群Ⅰ中.結合其形態特征 ,將其鑒定為G.cingulata f.sp.camelliae ,其中菌株ZRG與其余4株菌存在一定的基因差異.rDNA-ITS序列聚類分析與多基因系統發育分析結果相似 ,其中ZRG與其余4株菌的ITS序列差異明顯.DNAman 6.0多基因序列比對結果顯示 ,各菌株ITS序列一致性為99.44% ,菌株YFS、AHD、FHG和ABS的ITS基因序列一致性達100% ,與菌株ZRG之間存在16個堿基變異 ,分別為13、30、40、43、56、65、72、80、181、250、348、372、468、469、487、565基因位點.5株菌的GPDH和ACT基因序列差異完全一致 ,菌株FHG的Tub2基因序列與其余菌株的序列相比存在一個堿基變異.

3 討論

Hyde et al[22]研究表明 ,炭疽菌核糖體DNA-ITS序列保守性較高 ,部分不同種炭疽菌的ITS序列差異不明顯 ,基于病原菌形態學和ITS序列分析的方法在炭疽菌分類研究中還不夠完善 ,易造成誤判.形態學方法結合多基因系統進化分析是未來炭疽菌分類研究的重要手段[25－28].本研究測定了供試菌株的β-Tub2、ITS、GDPH、ACT等基因序列 ,最終證明基于這4段基因序列的多基因系統發育分析能準確鑒定出供試菌株的種類 ,并將其鑒定為G.cingulata f.sp.camelliae.該菌在新西蘭、美國、澳大利亞等國家的其他植物上均有發現；李應祥等[29]在貴州茶園也分離到該種病原菌.

圖3 基于β-Tub2、ITS、GPDH和ACT基因序列的多基因系統發育樹Fig.3 Multi-gene phylogenetic tree based on combined Tub2 ,ITS ,GPDH and ACT gene sequences

研究表明 ,炭疽病菌存在明顯的致病力分化現象[30－31].筆者于2012年對茶園炭疽病調查發現 ,茶樹炭疽病害的田間癥狀具有多樣性 ,有些茶園病害嚴重 ,有些茶園只發現少量的炭疽病葉.這種現象可能與茶樹品種的抗性差異有關 ,或由致病菌的致病力差異引起 ,因此有必要對茶樹炭疽病菌的致病力進行研究.本研究表明 ,不同菌株的致病力存在多樣性 ,分析不同致病力菌株的基因序列發現 ,其ITS基因序列存在差異 ,其中致病力較強的ZRG菌的ITS序列與其余4株菌相比存在16個堿基變異 ,這可能與其致病性存在一定的聯系.而多基因序列分析和形態學分析均支持它們是同種炭疽菌 ,只是出現了致病力的分化 ,是否是不同的生理小種還需進行深入研究.致病性測定表明 ,傷口是病原侵染的主要途徑 ,因此在進行茶園耕作時應盡量減少茶樹的機械損傷.另外 ,在培養過程中還發現 ,該類菌株純培養3次后就不再產生分生孢子 ,這使該類病原菌的傳播能力受到限制.因此 ,在茶園管理過程中應盡量避免將感染該病的枝葉帶入茶園而造成病害的擴散.

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(責任編輯:楊郁霞)

Identification and pathogenic analysis of the pathogen causing tea plant(Camellia sinensis)anthracnose

LIU Wei1 ,2,YE Nai-xing1 ,3,LIU Wei3,JIN Shan1 ,3,LIAN Ling-li4,LAI Jian-dong1,XIE Yun-hai1

(1.College of Horticulture ,Fujian Agriculture and Forestry University/Key Laboratory of Tea Science in Universities of Fujian Province ,Fuzhou ,Fujian 350002 ,China；2.Tea Science Department ,Xinyang College of Agriculture and Forestry ,Xinyang ,Henan 464000 ,China；3.Institute of Tea Science and Technology and Economy；4.College of Life Science ,Fujian Agriculture and Forestry University ,Fuzhou ,Fujian 350002 ,China)

Five isolates(tentatively named ZRG ,YFS ,ZHD ,ABS and FHG)of anthracnose specimens from 4 counties of Fujian Province were amplified and inoculated into healthy leaves for pathogenicity test.Morphological analysis was conducted via pure cul-tivation ,conidium andappressorium observation and subsequent β-Tub2 ,ITS ,GPDH and ACT genes were sequenced to construct a multi-gene phylogenetic tree.Results showed that all the five pathogens ,which presented similar colony and morphological features ,were Gloeosporium cingulata f.sp.camelliae that causes anthracnose.All the healthy leaves were infected with anthracnose with leaf that inoculated with ZRG isolate posed the worst symptoms.This was in accordance with sequencing results that ITS of the other 4 strains were significantly different from that of ZRG.

tea plant(Camellia sinensis)；Colletotrichum；pathogen identification；virulent；multiple gene phylogenetic analysis

S435.711

A

1671-5470(2015)06-0581-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.06.004

2015－03－26

2015－05－23

國家自然科學基金項目(31270735)；福建省“2011協同創新中心”中國烏龍茶產業協同創新中心專項(閩教科〔2015〕75號)；福建省科技廳星火計劃重點項目(2013S0065).

劉威(1985－) ,男 ,助教.研究方向:茶樹栽培育種與質量安全.通訊作者葉乃興(1963－) ,男 ,教授.研究方向:茶樹栽培育種與資源利用.Email:ynxtea＠126.com.