不同微量元素對斑玉蕈菌絲生長及酶活的影響

孫淑靜 ,單書凱 ,李釗鋒 ,郭艷艷 ,陳文星 ,胡開輝

(福建農林大學生命科學學院 ,福建福州350002)

不同微量元素對斑玉蕈菌絲生長及酶活的影響

孫淑靜 ,單書凱 ,李釗鋒 ,郭艷艷 ,陳文星 ,胡開輝

(福建農林大學生命科學學院 ,福建福州350002)

低脂肪、低熱量的珍稀名貴食用菌[13].但斑玉蕈在生產過程中生產周期較長(120－150 d) ,菌體生長速度慢 ,原料利用率低 ,從而增加了生產成本 ,影響了生產企業的效益[14－15].本研究通過探索微量元素對斑玉蕈新品種閩真1號在不同培養基質中菌絲生長和基質利用相關酶酶活的影響 ,為斑玉蕈實驗室菌絲培養及通過微量元素調節菌絲生長速度、提高基質降解效率方面的研究提供依據.

通過在PDA加富培養基和生產培養基中添加6種微量元素 ,探索不同條件下微量元素對斑玉蕈菌絲生長及基質降解有關酶的酶活的影響.結果表明:PDA加富培養基中添加100、60、500、100 mg?L－1的微量元素Mn2＋、Ca2＋、Mo6＋、Fe2＋,顯著促進菌絲生長；生產培養基中添加100 mg?kg－1的Fe2＋和Cu2＋對菌絲生長有明顯的促進作用 ,添加100 mg?kg－1Zn2＋對菌絲生長有抑制作用；生產培養基中添加100 mg?kg－1的Cu2＋顯著提高漆酶、錳過氧化物酶和木質素過氧化物酶的酶活 ,其酶活分別達到39.83、19.17和9.58 U?mL－1.表明每種微量元素對纖維素酶和木聚糖酶酶活的影響不顯著 ,在不同培養基中不同微量元素對斑玉蕈的菌絲生長及酶活的影響不同.

斑玉蕈；微量元素；菌絲生長速度；酶活

近年來 ,利用深層培養的真菌菌絲體來富集和轉化微量元素方面的研究引起人們關注[1－2],但微量元素對食用菌菌絲及酶活的影響的研究相對較少.微量元素對食用菌菌絲的生長速度和子實體的分化、發育、產量與品質方面有重要影響[3－4].微量元素還是某些酶的必要因子 ,食用菌木質素降解酶系高效降解食用菌培養基中的木質素 ,為食用菌菌體的生長提供營養 ,促進菌體和子實體的生長發育[5－7].同時酶活的高低可以衡量菌絲的代謝能力[8],從而反映菌株對基質的降解能力 ,影響食用菌的生產周期.因此 ,探索微量元素對食用菌菌絲生長、木質素降解酶系酶活的影響 ,對提高基質木質素的降解率、縮短食用菌生產周期、提高生物學效率具有重要意義.已有微量元素對平菇[9]、金針菇[10]、猴頭菌[11]等生長發育的影響的相關研究報道.郭艷艷等[12]對不同營養條件下斑玉蕈的菌絲生長及與基質利用相關的酶的產酶特性進行了研究.但微量元素對斑玉蕈在不同培養基質中菌絲生長發育及基質利用相關酶酶活影響的研究尚未見報道.

斑玉蕈Hypsizygus marmoreus(Peck)H.E.Bigelow又名玉蕈 ,屬傘菌目口蘑科玉蕈屬 ,是一種高蛋白、

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 斑玉蕈閩真1號 ,由福建農林大學微生物工程實驗室提供.

1.1.2 培養基 PDA加富培養基包括200 g?L－1馬鈴薯、20 g?L－1葡萄糖、3 g?L－1酵母粉、3 g?L－1蛋白胨、1.5 g?L－1KH2PO4、1.5 g?L－1MgSO4?7H2O、20 g?L－1瓊脂 ,pH自然；生產培養基包括71%棉籽殼、23%麥麩、5%玉米粉、1%生石灰 ,含水量65%.

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 向PDA加富培養基中分別添加10 g?L－1的MnSO4?H2O、無水CaCl2、Na2MoO4? 2H2O、ZnCl2、FeSO4?7H2O、CuSO4?5H2O溶液 ,使其在PDA加富培養基中終濃度分別為20、60、100、500 mg?L－1,即每種微量元素設置4個濃度梯度.

向生產培養基中分別添加MnSO4?H2O、無水CaCl2、Na2MoO4?2H2O、ZnCl2、FeSO4?7H2O、CuSO4? 5H2O ,使其在生產培養基中的終濃度為100 mg?kg－1.以不添加以上物質為對照 ,每個處理設3個重復.

1.2.2 菌株生長速度的測定 將待測菌株分別接種于PDA加富培養基、含Mn2＋、Ca2＋、Mo6＋、Zn2＋、Fe2＋、Cu2＋微量元素的培養基平板上 ,每種培養基做3個重復 ,置于24℃恒溫培養箱中培養.從第3天起每隔1 d測其菌絲生長速度.將待測菌株分別接種于生產培養基及含Mn2＋、Ca2＋、Mo6＋、Zn2＋、Fe2＋、Cu2＋微量元素的培養基試管中 ,每種培養基做3個重復 ,置于24℃恒溫培養箱中培養 ,從第10天起每隔10 d測其菌絲生長速度.

1.2.3 粗酶液的提取 分別將接種前以及菌絲長10、20、30、40 d時試管中的栽培料全部取出(接種前試管栽培料為32 g) ,在粉碎機里將其粉碎 ,混勻后 ,稱取10 g置250 mL三角瓶中 ,然后加入50 mL無菌水 ,置于24℃、110 r?min－1的搖床中浸提2 h ,過濾離心 ,取其上清液 ,即為粗酶液.

1.2.4 漆酶活性的測定 參照吳涓等[16]的方法 ,取2.7 mL HAc-NaAc緩沖液(pH＝4.5)、0.1 mL 1 mmol? L－1ABTS溶液、0.2 mL粗酶液 ,在30℃下 ,測定反應開始前3 min的D420nm增量.設3個重復 ,以滅活15 min的粗酶液作為空白對照.

1.2.5 錳過氧化物酶酶活的測定 參照周金燕等[17]的方法 ,取1.5 mL酶液 ,含有終濃度為0.4 mmol?L－1的愈創木酚、0.1 mmol?L－1的H2O2、0.2 mmol?L－1的MnSO4及50 mmol?L－1的琥珀酸鈉緩沖體系(pH＝4. 5) ,以0.1 mmol?L－1的H2O2啟動反應.在40℃下 ,測定反應開始前3 min的D465nm增量.設3個重復 ,以滅活15 min的粗酶液作為空白對照.

1.2.6 木質素過氧化物酶酶活的測定 參照莢榮等[18]的方法 ,取1.5 mL 0.2 mol?L－1酒石酸鈉緩沖液(pH＝3.0)、1.0 mL15 mmol?L－1藜蘆醇、0.6 mL酶液 ,以0.1 mL 15 mmol?L－1H2O2啟動反應.在40℃下 ,測定反應開始前1 min的D310nm的增量.設3個重復 ,以去離子水作為空白對照.

1.2.7 纖維素酶酶活的測定 參照趙玉萍等[19]的方法 ,在具塞試管中加入(50±1)mg濾紙、1 mL酶液和1 mL 100 mmol?L－1HAc-NaAc緩沖液(pH＝4.6) ,置于50℃恒溫水浴鍋中保溫1 h ,取出后立即加入3 mL DNS溶液 ,沸水顯色5 min ,冷卻至室溫 ,加蒸餾水定容至25 mL ,測D520nm值.設3個重復 ,以滅活15 min的粗酶液作為空白對照.

1.2.8 木聚糖酶酶活的測定 參照劉蘋等[20]的方法 ,在具塞試管中加入1.5 mL 1%(體積分數)木聚糖溶液、0.5 mL酶液 ,置于50℃恒溫水浴鍋中保溫20 min ,取出后立即加入3 mL DNS溶液 ,沸水顯色5 min ,冷卻至室溫 ,加蒸餾水定容至10 mL ,測D550nm值.設3個重復 ,以滅活15 min的粗酶液作為空白對照.

1.2.9 數據處理 數據統計分析采用DPS 7.05數據處理軟件 ,采用單因素方差分析法進行差異顯著性檢驗.

2 結果與分析

2.1 不同微量元素對菌絲生長的影響

2.1.1 PDA加富培養基平板上菌絲的生長速度 由圖1、2可知 ,在PDA加富培養基平板上 ,不同微量元素對閩真1號菌絲生長的影響不同 ,同一微量元素在不同濃度下對閩真1號菌絲生長的影響也不同. Mn2＋、Ca2＋、Mo6＋、Fe2＋對菌絲的生長有促進作用 ,其添加量分別為100、60、500、100 mg?L－1時 ,菌絲直徑分別為7.18、7.15、7.28、7.13 cm ,與對照(6.92 cm)相比差異顯著；Cu2＋對菌絲生長有明顯的抑制作用 ,當其質量濃度為20 mg?L－1時 ,菌絲直徑為5.74 cm ,與對照(6.92 cm)相比差異極顯著；Zn2＋對菌絲生長影響不大 ,只有當其質量濃度為500 mg?L－1時對菌絲生長有顯著的抑制作用.

圖1 添加不同微量元素的PDA加富培養基平板上菌絲直徑Fig.1 The mycelia diameter on enriched PDA media with different concentration and different trace elements

圖2 添加不同微量元素的PDA加富培養基平板上菌絲的生長速度Fig.2 The mycelia growth rates on enriched PDA media with different trace elements

2.1.2 生產培養基中菌絲的生長速度 在生產培養基中添加100 mg?kg－1不同金屬離子 ,由表1和圖3可知:在第36天 ,Mn2＋、Fe2＋、Cu2＋對菌絲生長有顯著的促進作用 ,Zn2＋對菌絲生長有抑制作用 ,在添加30和36 d后 ,菌絲高度分別為4.93、6.70 cm ,與對照(6.82、8.33 cm)相比 ,差異顯著；而Ca2＋、Mo6＋對菌絲生長的影響不顯著.表明在PDA加富培養基上添加不同微量元素對閩真1號菌絲生長的影響是不同的 ,特別是Cu2＋對不同營養條件下菌絲生長速度影響的差異性較大.

表1 添加不同微量元素的生產培養基中菌絲高度1)Table 1 The mycelia height in production media with different trace elementscm

2.2 不同微量元素對酶活的影響

2.2.1 不同微量元素對漆酶酶活的影響 生產培養基中 ,在菌絲生長起始階段檢測不到漆酶；當菌絲長至第30天時 ,添加Mn2＋、Ca2＋、Mo6＋、Fe2＋、Cu2＋的生產培養基中可以檢測到漆酶 ,但酶活較低；當菌絲生長40 d后 ,漆酶酶活增大；添加Mn2＋和Fe2＋后漆酶酶活分別為18.67和19.68 U?L－1,與對照(17.00 U?L－1)相比差異顯著(P<0.05).添加Ca2＋、Mo6＋和Zn2＋抑制漆酶酶活 ,漆酶酶活分別為1.25、2.42和1.00 U?L－1,與對照(17.00 U?L－1)相比差異顯著(P<0.05).添加Cu2＋的生產培養基中 ,漆酶酶活最高 ,為39.83 U?L－1,是對照的2.34倍.由此可知 ,100 mg?kg－1的Cu2＋對漆酶的分泌有促進作用 ,是漆酶的一個激活劑.

2.2.2 不同微量元素對錳過氧化物酶活酶活的影響

由圖4可看出 ,在菌絲生長初期檢測不到錳過氧化物酶；當菌絲長至第20天時 ,可以檢測到錳過氧化物酶 ,各金屬離子對錳過氧化物酶酶活沒有顯著性影響；隨著培養時間的增加 ,錳過氧化物酶酶活逐漸增大.但在整個菌絲生長過程中 ,錳過氧化物酶酶活都比較低 ,與對照相比 ,在第40天添加Cu2＋對錳過氧化物酶酶活有顯著的促進作用；而Mn2＋、Ca2＋、Mo6＋、Zn2＋對錳過氧化物酶酶活有顯著的抑制作用.

2.2.3 不同微量元素對木質素過氧化物酶酶活的影響 隨著菌絲培養時間的增加 ,木質素過氧化物酶酶活先逐漸升高 ,隨后降低.在整個生長階段 ,木質素過氧化物酶的活性都不高 ,在菌絲生長至第30天時 ,酶活達到最大.添加Cu2＋的培養基中木質素過氧化物酶的活性最高 ,達9.58 U?mL－1,與對照(6.77 U?mL－1)相比差異顯著 ,結果見圖5.

2.2.4 不同微量元素對纖維素酶酶活的影響 由圖6可看出 ,在整個菌絲生長階段 ,隨著培養時間的增加 ,纖維素酶酶活逐漸增大.與對照相比 ,添加Mn2＋、Ca2＋、Mo6＋對菌絲生長后期纖維素酶酶活有明顯的抑制作用；而添加Zn2＋、Fe2＋、Cu2＋對纖維素酶酶活有輕微的促進作用 ,差異不顯著.

2.2.5 不同微量元素對木聚糖酶酶活的影響 在整個菌絲生長階段 ,隨著培養時間的增加 ,木聚糖酶酶活逐漸增大；但在菌絲生長后期 ,酶活會稍微降低 ,各種微量元素對木聚糖酶酶活影響不大.添加Zn2＋、Fe2＋對木聚糖酶活性有顯著的抑制作用 ,結果見圖7.在整個菌絲生長階段 ,木聚糖酶酶活比其他酶酶活大 ,表明木聚糖酶對菌絲后期的生長起著非常重要的作用.

圖3 添加不同微量元素的生產培養基中菌絲生長速度Fig.3 The mycelia growth rate in production media with different trace elements

圖4 不同微量元素對錳過氧化物酶酶活的影響Fig.4 Effect of different trace elements on the activities of manganese peroxidase

圖5 不同微量元素對木質素過氧化物酶酶活的影響Fig.5 Effect of different trace elements on the activities of lignin peroxidase

圖6 不同微量元素對纖維素酶酶活的影響Fig.6 Effect of different trace elements on the activities of cellulase

3 討論

不同微量元素及同一微量元素在不同濃度下對斑玉蕈的菌絲生長和酶活的影響程度各不相同.PDA加富培養基中添加Zn2＋對菌絲生長影響不大 ,根據王宜磊[21]的報道 ,這有可能是Cl－的影響 ,而選用Zn-SO4會促進平菇菌絲生長.在生產培養基中添加Zn2＋,對菌絲生長有明顯的抑制作用 ,這可能是由于所添加的Zn2＋的濃度偏高 ,根據王曉光[22]的報道 ,低濃度的Zn2＋對菌絲體的生長有促進作用 ,但高濃度的Zn2＋對菌絲體的生長有抑制作用.在PDA加富培養基中添加Cu2＋對菌絲生長有明顯的抑制作用 ,而在生產培養基中添加Cu2＋對菌絲生長卻有顯著的促進作用 ,可能是由于在PDA加富培養基中添加Cu2＋的濃度偏高.根據Poitou et al[9]和Hatvani et al[10]的報道 ,低濃度的Cu2＋對菌絲生長起促進作用 ,高濃度的Cu2＋對菌絲的生長則起著抑制作用.在PDA加富培養基中添加Mn2＋,對菌絲生長有明顯的促進作用 ,當濃度為100 mg?L－1時 ,促進作用最顯著；但向生產培養基中添加Mn2＋對菌絲生長影響不明顯.根據Niess et al[11]的報道 ,Mn2＋對糙皮側耳菌絲的生長有促進作用.但Hatvani et al對香菇的研究[10]表明 ,在培養基中添加3.1 mmol?L－1MnSO4,對香菇菌絲生長有抑制作用 ,使其菌絲生長速度下降了50%.因此 ,Mn2＋對菌株生長速度的影響 ,與菌株的種類和培養菌株的基質都有關系.

圖7 不同微量元素對木聚糖酶酶活的影響Fig.7 Effect of different trace elements on the activities of xylanase

本研究結果表明 ,銅能提高漆酶的活性 ,這與劉杰在杏鮑菇中的研究一致[23].在菌絲整個生長階段 ,添加的100 mg?kg－1MnSO4?H2O對錳過氧化物酶酶活大小的影響不明顯 ,這可能是由于生產培養基中所添加的錳的濃度偏高.張連慧等[24]研究結果表明Mn2＋對菌體的生長很有利 ,但對菌體產錳過氧化物酶并無顯著影響.在生產培養基中添加MnSO4?H2O ,使得木質素過氧化物酶的酶活有所下降.李華鐘等[25]研究表明 ,適量的Mn2＋可提高木質素過氧化物酶的活性 ,當大量的Mn2＋被氧化成Mn3＋時 ,會抑制木質素過氧化物酶的表達 ,本研究中所添加的Mn2＋濃度可能偏高.本研究結果也表明 ,Ca2＋對木聚糖酶有激活作用 ,Fe2＋、Zn2＋對木聚糖酶酶活有抑制作用 ,這與趙玉蓉[26]研究金屬離子對木聚糖酶活性影響的結果一致.

[1]陸曉民 ,李世軍.微量元素鋅在金針菇培養中的應用研究[J].中國林副特產 ,2006 ,84(5):8－10.

[2]王新風.富硒食用菌栽培技術[J].中國食用菌 ,2002 ,21(3):13－15.

[3]謝必峰 ,林琳 ,施巧琴 ,等.微量元素對食用菌生理效應的研究[J].中國食用菌 ,1996 ,15(3):11－13.

[4]劉雁英 ,李林輝 ,謝富剛 ,等.食用菌子實體分化發育研究進展[J].菌物研究 ,2010 ,8(1):57－62.

[5]史留功 ,樊金獻 ,朱自學.微量元素對平菇生長的影響[J].農業與技術 ,2007 ,27(6):84－86.

[6]閆永亮 ,牛顏冰.不同礦質元素對香菇生長發育影響的研究[J].現代農業科技 ,2008 ,22:11－12.

[7]張遠瓊.微量元素促進金針菇生長的初步研究[J].中國食用菌 ,1995 ,14(2):30－31.

[8]張淵 ,王謙 ,張筱梅 ,等.白靈側耳木質素酶、纖維素酶高活性菌株的誘變選育[J].河北大學學報:自然科學版 ,2005 ,25 (6):654－658.

[9]POITOU N ,OLIVIER J M.Effect of copper on mycelium of three edible ectomycorrhizal fungi[J].Agriculture ,Ecosystems and Environment ,1990 ,28:403－408.

[10]HATVANI N ,MèCS I.Effects of certain heavy metal on the growth ,dye decolorization and enzyme activity of Lentinula edodes[J].Ecotoxicology and Environmental Safety ,2003 ,55(2):199－203.

[11]陸曉民 ,桂艷華 ,陳義偉.微量元素硒在猴頭菇栽培中的應用研究初探[J].中國林副特產 ,2006 ,81(2):23－24.

[12]郭艷艷 ,阮玲云 ,馮宏昌 ,等.不同營養條件下斑玉蕈菌絲生長及產酶特性[J].菌物學報 ,2014 ,31(3):697－705.

[13]鄭峻 ,林友照 ,胡開輝.真姬菇工廠化栽培關鍵技術[J].福建農業 ,2006 ,8:18－19.

[14]胡開輝 ,出小平.外界因子對蟹味菇菌絲特性的影響[J].中國食用菌 ,2008 ,27(2):16－18 ,22.

[15]孫淑靜 ,顏松 ,胡開輝 ,等.斑玉蕈不同菌種類型的生產性能[J].河南科技大學學報:自然科學版 ,2010 ,31(1):66－69 ,118.

[16]吳涓 ,肖亞中 ,王怡平 ,等.蜜環菌胞外漆酶酶活力的分光光度法測定[J].廈門大學學報:自然科學版 ,2001 ,40(4):893－898.

[17]周金燕 ,張發群 ,舒遠才.愈創木酚法測定錳過氧化物酶活力[J].纖維素科學與技術 ,1993 ,1(1):34－37.

[18]莢榮 ,湯必奎 ,張曉賓 ,等.藜蘆醇和吐溫80對白腐菌產木質素降解酶的影響及在偶氮染料脫色中的作用[J].生物工程學報 ,2004 ,20(2):302－305.

[19]趙玉萍 ,楊娟.四種纖維素酶酶活測定方法的比較[J].食品研究與開發 ,2006 ,27(3):116－118.

[20]劉蘋 ,唐志紅 ,李夢玉 ,等.金針菇漆酶活性測定的最佳反應條件及液體培養胞外酶的研究[J].食品科技 ,2012 ,37(6): 14－17.

[21]王宜磊 ,鄧振旭.Zn2＋對平菇生長發育的影響[J].食用菌 ,1998 ,2:12－13.

[22]王曉光 ,曾憲錄 ,王緒田 ,等.Cu2＋、Zn2＋濃度對深層培養的松茸菌絲體生長的影響[J].農業與技術 ,1994 ,6:4－6.

[23]劉杰.微量元素錳、銅對杏鮑菇相關生理特性的影響[D].福州:福建農林大學 ,2012.

[24]張連慧 ,劉衛曉 ,葛克山 ,等.變色栓菌產錳過氧化物酶的條件優化[J].微生物學通報 ,2005 ,32(5):98－102.

[25]李華鐘 ,章燕芳 ,華兆哲 ,等.黃孢原毛平革菌選擇性合成木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶[J].過程工程學報 ,2002 ,2(2):137－141.

[26]趙玉蓉 ,金宏 ,陳清華 ,等.金屬離子對纖維素酶及木聚糖酶活性影響的研究[J].飼料博覽 ,2005(1):1－3.

(責任編輯:葉濟蓉)

Effects of trace elements on the mycelial growth and enzyme activities of Hypsizygus marmoreus

SUN Shu-jing ,SHAN Shu-kai ,LI Zhao-feng ,GUO Yan-yan ,CHEN Wen-xing ,HU Kai-hui
(College of Life Sciences ,Fujian Agriculture and Forestry University ,Fuzhou ,Fujian 350002 ,China)

Effects of trace elements on the mycelial growth rate and activities of some enzymes related to substrate degradation of Hypsizigus marmoreus were explored under different cultivation conditions by addition of six trace elements in enriched PDA media and production media.The results showed some metal ions(Mn2＋,Ca2＋,Mo6＋and Fe2＋)could significantly accelerate the mycelial growth in enriched PDA media with the concentration of 100 ,60 ,500 and 100 mg?L－1,respectively.Adding Fe2＋and Cu2＋in pro-duction media had remarkable promoting effects on mycelial growth.Zinc ion inhibited the growth of mycelia when it was added to production media.Copper ion supplementation(100 mg?kg－1)in production media was most beneficial to the activities of laccase ,manganese peroxidase and lignin peroxidase(reaching 39.83 ,19.17 and 9.58 U?mL－1,respectively).However ,there were no sig-nificant effects of all trace elements on the activities of cellulase and xylanase.It suggested that different trace elements had different effects on the mycelial growth of H.marmoreus and the activities of its related enzyme in different substrates.

Hypsizygus marmoreus；trace element；mycelial growth rate；enzyme activity

S63

A

1671-5470(2015)06-0639-07

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.06.014

2015－01－09

2015－06－15

福建省發改委農業五新工程項目(閩發改委投資[2012]931號)；福建省自然基金杰出青年項目(2014J06010)；福建農林大學校杰出青年人才項目(xjq201209)；國家自然基金青年項目(31201669)；教育部博士點基金資助項目(20103515120015).

孫淑靜(1978－) ,女 ,副教授 ,博士.研究方向:食用菌遺傳育種、基因功能及酶學.Email:shjsun2004＠126.com.通訊作者胡開輝(1962－) ,男 ,教授 ,博士生導師.研究方向:微生物生態和食用真菌.Email:hukaihui62＠126.com.