異養硝化-好氧反硝化菌脫氮同時降解苯酚特性

王國英,崔 杰,岳秀萍,李亞男,賈子龍 （太原理工大學環境科學與工程學院,山西 太原 030024）

異養硝化-好氧反硝化菌脫氮同時降解苯酚特性

王國英,崔 杰,岳秀萍*,李亞男,賈子龍 （太原理工大學環境科學與工程學院,山西 太原 030024）

研究了異養硝化-好氧反硝化菌Diaphorobacter sp. PDB3去除氨氮同時降解苯酚的特性.在最佳碳氮比7和搖床轉速160r/min下,該菌在21h內對初始濃度365mg/L苯酚的降解率達94.9%,總有機碳去除率達90.8%,同時40mg N/L氨氮被完全去除,中間代謝物硝態氮和亞硝態氮逐漸積累并在后期降低.氮平衡分析表明,52.3%的氨氮轉化為胞內氮,37.2%轉化為氮氣,菌株主要通過細胞同化作用和異養硝化-好氧反硝化作用去除氨氮.檢測到羥胺氧化酶、硝酸還原酶及亞硝酸還原酶活性,表明菌株PDB3具有完整的異養硝化-好氧反硝化偶聯途徑.隨著苯酚濃度升高,抑制作用增強,脫氮效率降低.

異養硝化；好氧反硝化；苯酚；氨氮

苯酚是焦化、石油化工等工業排放廢水中主要污染物之一［1-2］.酚類廢水往往同時含有氨氮,是水體中的主要耗氧污染物［3］.因此同時去除苯酚和氨氮對于含氨氮酚類廢水的高效處理十分必要.一些研究者［4-7］發現,苯酚和氨氮的去除可通過自養硝化菌和異養菌在好氧條件下配合完成,但是苯酚對自養硝化產生強抑制作用,降低硝化速率,如 Amor等［4］發現,苯酚完全降解后硝化反應才開始,Liu等［7］發現,15mg/L苯酚存在時硝化產物硝態氮的產生速率為沒有苯酚時的 77%.此外,氨氮僅被氧化為硝態氮或亞硝態氮,其仍需在厭氧或缺氧條件下還原為氮氣,造成系統復雜、過程耗時.

傳統脫氮理論認為硝化和反硝化是兩個獨立的過程［8-9］.然而近些年來,一些異養硝化-好氧反硝化菌被分離出來［10-14］,這些細菌進行異養硝化同時進行好氧反硝化反應,將氨氮最終轉化為氮氣.與自養硝化菌比,這些菌具有生長速度快,環境適應能力強,去除氨氮同時降解有機物等優點.但是此類研究多以乙酸、琥珀酸和檸檬酸等有機酸為碳源,對以毒害物質如苯酚、甲酚等為底物的研究鮮有報道.

本實驗室前期分離得到一株異養硝化-好氧反硝化苯酚降解菌Diaphorobacter sp. PDB3［15］,對其降解苯酚和反硝化特征進行了研究,但是其異養硝化特性和脫氮途徑還未明了.本研究考察菌種的氨氮去除和苯酚降解特征,對脫氮產物及脫氮途徑進行分析,為異養硝化-好氧反硝化苯酚降解菌的實際應用提供理論依據.

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株 異養硝化-好氧反硝化苯酚降解菌Diaphorobacter sp. PDB3由本實驗室篩選保藏［15］.

1.1.2培養基 LB培養基（g/L）：胰蛋白胨10,酵母浸出粉 5,NaCl 10.pH 7.2.

無機鹽培養基（g/L）：NH4Cl 0.153,K2HPO40.5, KH2PO40.5, CaCl20.1, MgSO4?7H2O 0.2, NaMoO4?2H2O 0.01, MnSO4?H2O 0.01, Fe2（SO4）3?H2O 0.01, ZnSO4?7H2O 0.01, CuSO4?5H2O 0.01, CoCl2?6H2O 0.01.pH 7.2.

以上培養基用高壓蒸汽滅菌器在 121℃滅菌20min,苯酚按需要量加入.

1.2實驗方法

1.2.1搖床實驗 將菌株接種至含有 100mg/L苯酚的LB培養液中,在搖床中連續活化2代,將細胞清洗后接種至含有苯酚的100mL無機鹽培養基中,30℃下搖瓶振蕩培養,每隔適宜時間取樣檢測細胞濃度,在4℃及8000r/min下離心15min,取上清液測量苯酚、總有機碳（TOC）、總氮（TN）、NH4+-N、NH2OH-N、NO3--N及NO2--N含量.

1.2.2氮平衡分析實驗 將100mL含有苯酚的無機鹽培養基裝入250mL厭氧瓶,接種后向厭氧瓶中充入純氧氣,用瓶塞塞緊瓶口,在 30℃下振蕩培養27h.用注射器取瓶中氣體測量O2、N2和N2O含量.取培養液離心后取上清液測量苯酚、TN、NH4+-N、NH2OH-N、NO3--N及NO2--N,取沉淀測量胞內氮.

1.2.3細胞粗酶液的提取 將菌株接種至無機鹽培養基中,培養至對數生長期后期,將菌液在4℃,12000r/min下離心,收集菌體,用磷酸鹽緩沖液清洗2次后重懸細胞,置于冰水混合物中,用超聲破碎儀破碎細胞,再次12000r/min離心,收集上清液,即為粗酶液.以上實驗均重復3次.

1.3分析方法

細胞濃度的測定采用可見分光光度法,在600nm波長下測定培養液的吸光度（OD600）,根據細胞干重標準曲線將其轉換為細胞干重；溶解氧采用溶解氧分析儀（HQ30d,美國哈希）測量；TOC 和TN用TOC/TN分析儀 （TOC-VCPH/TNM-1,日本島津）測量； NH4+-N、NO2--N和NO3--N的測定分別采用納氏試劑分光光度法、N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法和酚二磺酸分光光度法；NH2OH-N測定參照文獻［16］；有機氮為TN減去NH4+-N、NO2--N及NO3--N之和；胞內氮含量用元素分析儀（EA3000,意大利歐維特）測量；苯酚用高效液相色譜儀（P1201,大連依力特）測量；O2和 N2用配有熱導檢測器的氣相色譜儀（456GC,美國布魯克）測量；N2O用配有電子捕獲器的氣相色譜儀（6890,美國安捷倫）測量.

酶活分析參照 Zhao等［17］的方法：羥胺氧化酶測定體系10mL,內含10mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH7.1）,0.11mmol/L細胞色素c和粗酶液；硝酸還原酶和亞硝酸還原酶測定體系各 10mL,內含10mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH7.4）,0.2mmol/L NADH和粗酶液.分別向反應體系中加入羥胺、NaNO3及 NaNO2,并測定羥胺消耗速率、NO2-生成速率及 NO2-消耗速率.總蛋白含量用Bradford法測定［18］.活力單位（U）為每分鐘轉化1μmol 底物所需酶量.酶的比活力以每毫克的蛋白質中所含酶的活力單位數計算.

2　結果與討論

2.1碳氮比對苯酚降解和氨氮去除的影響

如圖 1所示,隨著碳氮比升高,Diaphorobacter sp. PDB3對氨氮的去除率升高,苯酚降解率降低,當碳氮比升高至13時,苯酚降解率下降至61.2%.苯酚為菌體生長代謝提供能源和碳源,低碳氮比時碳源不足,細胞代謝能力不足,導致氨氮去除率較低；高碳氮比時,碳源的供給高于菌體所需,碳源濃度不再是限制性因素,氨氮去除率不再增加.當碳氮比為7時,苯酚降解率和氨氮去除率都處于較高的水平,因此最佳碳氮比為7.

圖1　碳氮比對苯酚降解和氨氮去除的影響Fig.4　Effect of C/N ratio on phenol degradation and ammonium removal

2.2搖床轉速對苯酚降解和氨氮去除的影響

圖2　搖床轉速對菌株培養15h后苯酚降解和氨氮去除的影響Fig.4　Effect of shaking speed on phenol degradation and ammonium removal after strain incubation for 15h

苯酚好氧降解的第一步是苯酚被苯酚羥化酶催化為鄰苯二酚,異養硝化的第一步是氨被氨單加氧酶催化為羥胺,這2個反應都需要氧分子的參與,因此溶氧可影響 Diaphorobacter sp. PDB3的苯酚降解和氨氮去除能力.在搖床轉速80,120,160,200r/min下實驗初期（1h）培養液的溶氧 分 別 為 （5.43±0.02）,（6.11±0.03）,（6.62±0.04）,（6.80±0.04）mg/L,因此提高搖床轉速可以提高培養液中溶氧水平.如圖2所示,隨著搖床轉速提高,苯酚降解率和氨氮去除率均提高；搖床轉速達到160r/min時,苯酚降解率漸趨穩定,氨氮去除率達到最大；當搖床轉速為200r/min時,苯酚降解率沒有明顯變化,表明溶氧不再是苯酚降解的限制因素,而氨氮去除率降低,說明溶氧過低或過高均不利于氨氮去除,與 Acinetobacter sp. Y16［19］和Bacillus methylotrophicus strain L7［11］的特性一致.選擇160r/min為最佳搖床轉速.

2.3菌體生長及異養硝化-好氧反硝化特性

如圖3a所示,菌體經歷3h的延滯期后,進入對數生長期,細胞濃度快速增長,最大比生長速率為0.14/h,高于自養硝化菌Nitrosomonas europaea的0.03～0.05/h［20］.苯酚在細胞對數生長期被大量降解,于21h降解率達到94.9%.細胞生長與苯酚降解是同步的,證明了菌株的異養代謝能力.總有機碳與苯酚的降解趨勢相似,21h去除率為 90.8%,表明培養液中剩余有機物含量較低,苯酚主要轉化為無機碳和胞內碳.

氨氮濃度在細胞對數生長期內顯著降低（圖3b）,最終于 21h被完全去除,最大去除速率為3.2mg NH4+-N/（L?h）.Alcaligenes faecalis no.4［21］和Acinetobacter junii YB［10］的最大去除速率分別為24,10.09mg NH4+-N/（L?h）,均高于本研究.這些報道中所用碳源為檸檬酸鹽和琥珀酸鹽,比苯酚更容易被細胞利用,且沒有毒性,細胞生長速度快,因此有更高的氨氮去除速率.

隨著氨氮的消耗,中間代謝物 NO2-和 NO3-逐漸積累,最大濃度分別于12h和9h達到1.07, 1.92mg N/L,隨后逐漸降低,沒有檢測到NH2OH-N,可能被迅速轉化為下游代謝物.其它異養硝化-好氧反硝化菌的研究［10-12］中同樣發現了硝化產物的積累和消耗.原因可能是實驗前期氨氮充足,異養硝化作用強于好氧反硝化作用,硝化產物累積；后期氨氮濃度降低,好氧反硝化作用強于異養硝化作用,硝化產物被還原. Acinetobacter calcoaceticus HNR［17］和Alcaligenes faecalis NR［22］表現出不同的變化特征,這2株菌無法利用硝態氮進行反硝化反應,在脫氮過程后期硝態氮濃度沒有降低,而是逐漸積累.本文中硝態氮后期的變化情況及前期研究［15］均表明,菌株PDB3能夠以硝態氮為底物進行反硝化反應.總氮與氨氮的去除趨勢相似,最終去除率為 96.3%,沒有完全去除的主要原因是代謝中間物和細胞裂解物的積累.

圖3　菌株在苯酚初始濃度為365mg/L的無機鹽培養基中苯酚降解,菌體生長及氨氮去除曲線Fig.4　Characteristics of phenol degradation, ammonium removal and cell growth in the mineral salt medium with initial phenol concentration of 365mg/L

Wehrfritz等［23］提出的異養硝化代謝理論認為,氨單加氧酶催化NH3生成NH2OH,這個過程由還原型輔酶Q提供電子；NH2OH轉化NO2--N過程產生的電子通過細胞色素復合物傳遞給反硝化還原酶系,不像自養硝化菌中電子傳遞給輔酶Q.因此輔酶Q是通過有機碳源的代謝得到電子,從而給氨單加氧酶提供電子.可見異養硝化菌對氨氮的去除和有機碳源的利用是偶聯的.從圖3可見,苯酚降解趨勢和氨氮去除趨勢相似,苯酚降解產生的電子傳遞給氨單加氧酶,使氨氮同步去除.Amor等［4］和Kim等［5］在污泥降解實驗中發現苯酚的存在抑制了硝化反應,苯酚完全降解后硝化反應才開始,可見自養硝化與苯酚降解不是偶聯的.

2.4氮平衡分析

密封瓶實驗中各物質的氮含量如表1所示.在實驗末期,氨氮全部去除,只有少量的硝化產物積累,胞內氮由0.35mg增長到2.43mg,增長量占氨氮去除量的52.3%,氮氣產量為1.48mg,占氨氮去除量的37.2%,沒有檢測到N2O. N2O是好氧反硝化過程的中間代謝物,具有溫室效應. Schalk-Otte等［24］認為,反硝化過程釋放N2O的主要原因是碳源不足,當碳源充足時,電子供應充足,各還原酶之間沒有競爭性抑制,一氧化二氮還原酶的活性可以正常發揮,使N2O及時轉化為N2,避免N2O逸出.本文中苯酚在實驗末期仍有剩余,碳源充足,是N2O沒有逸出的主要原因.胞內氮和氮氣合計占氨氮去除量的89.5%,可見菌株PDB3主要通過細胞同化作用和異養硝化-好氧反硝化作用脫氮,與其他異養硝化-好氧反硝化菌［10,12,19］的研究結果一致.在實驗末期溶液中含有少量的有機氮,可能來自于細胞裂解物.

表1　菌株PDB3脫氮過程中氮平衡分析Table 1　Nitrogen balance analysis in nitrogen removal by strain PDB3

2.5脫氮途徑分析

異養硝化菌有2種脫氮途徑,常見的是異養硝化-好氧反硝化偶聯途徑：首先 NH3轉化為NH2OH,羥胺氧化酶催化NH2OH生成NO2-,NO2-可轉化為 NO3-,NO2-和 NO3-分別被亞硝酸還原酶和硝酸還原酶還原為NO和NO2--N,最終被還原為含氮氣體 N2O/N2.和偶聯途徑不同,Acinetobacter calcoaceticus HNR［17］和Alcaligenes faecalis NR［22］是通過 NH2OH 而非NO2-或NO3-生成含氮氣體,并且沒有亞硝酸還原酶和硝酸還原酶活性.通過測量脫氮途徑中酶的活性,可以明確Diaphorobacter sp. PDB3的脫氮途徑.結果表明羥胺氧化酶、亞硝酸還原酶和硝酸還原酶活性分別為（0.016 ± 0.003）,（0.029 ± 0.005）, （0.012 ± 0.002）U/mg蛋白質，表明菌株PDB3脫氮途徑是異養硝化-好氧反硝化偶聯途徑（圖4）.

圖4　Diaphorobacter sp. PDB3的脫氮途徑Fig.4　Nitrogen removal pathway of Diaphorobacter sp. PDB3

2.6苯酚濃度對脫氮作用的影響

如圖5所示,隨著苯酚濃度升高,細胞延滯期增長,最終細胞濃度逐漸升高,同時氨氮去除耗時增長.初始苯酚濃度522,679mg/L下,胞內氮增長量占氨氮去除量的比率分別為 56.2%和 61.1%,說明隨著苯酚濃度的升高,更多的氨氮用于合成細胞而不是進入異養硝化途徑.

異養硝化-好氧反硝化菌可以同時通過異養硝化-好氧反硝化途徑和以氧為電子受體的呼吸鏈產能［13,23］,然而前者低于后者的產能效率［23］,在氮源相對較少和溶氧充足時,菌體優先利用產能效率高的途徑即氧化呼吸鏈產能,而不是異養硝化-好氧反硝化途徑.同時碳源充足時可以產生更多的碳骨架,有利于細胞生長.因此在更高的苯酚濃度下,更少的氨氮進入異養硝化途徑.

苯酚不僅可以改變細胞膜通透性［25］,而且能夠使酶蛋白變性［26］,其毒害作用隨著濃度增高而加強,也是異養硝化作用減弱的原因之一.自養硝化作用通常對苯酚敏感,例如 Stafford［6］發現5.6mg/L苯酚對自養硝化作用產生了 75%的抑制,Liu等［7］發現20mg/L苯酚存在時氨氮去除耗時約為沒有苯酚時的2倍.菌株PDB3在較高的苯酚濃度下仍然發生異養硝化作用,說明其對苯酚的耐受度比自養硝化菌強. Diaphorobacter sp. PDB3能利用苯酚為碳源去除氨氮,具有一定的處理含氨氮苯酚廢水應用前景；今后將研究相關功能基因的表達,進一步揭示脫氮機理,并研究反應器水平的工藝條件,為其實際應用提供支持.

圖5　苯酚初始濃度365,522,679mg/L對細胞生長和氨氮去除的影響Fig.4　Effect of phenol at initial concentrations of 365, 522 and 679mg/L on cell growth and ammonium removal

3　結論

3.1Diaphorobacter sp. PDB3的最佳苯酚降解和氨氮去除條件為碳氮比 7,搖床轉速160r/min.在此條件下,菌株 21h內對初始濃度365mg/L苯酚的降解率為94.9%,總有機碳去除率為90.8%,同時初始濃度40mg N/L氨氮被完全去除,中間代謝物硝態氮和亞硝態氮逐漸積累并在后期降低.

3.2氮平衡分析表明,氨氮去除量的52.3%轉化為胞內氮,37.2%轉化為氮氣,沒有檢測到N2O,菌株主要通過細胞同化作用和異養硝化-好氧反硝化作用去除氨氮.

3.3酶活分析檢測到羥胺氧化酶、硝酸還原酶及亞硝酸還原酶活性,表明菌株 PDB3具有完整的異養硝化-好氧反硝化偶聯途徑.

3.4隨著苯酚濃度升高,脫氮效率降低,原因一是菌體優先利用氧化呼吸鏈而非異養硝化-好氧反硝化途徑產能,原因二是苯酚的抑制作用增強.

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Simultaneous removal of phenol and ammonium by a heterotrophic nitrifiying-aerobic denitrifying bacterium.

WANG Guo-ying, CUI Jie, YUE Xiu-ping*, LI Ya-nan, JIA Zi-long （College of Environmental Science and Engineering, Taiyuan University of Technology, Taiyuan 030024, China）.

China Environmental Science, 2015,35（9）：2644～2649

The simultaneous removal of phenol and ammonium by a heterotrophic nitrifying-aerobic denitrifying bacterium Diaphorobacter sp. PDB3 was investigated. The optimal C/N ratio was 7and the optimal shaking speed was 160r/min. The strain degraded 94.9% of 365mg/L phenol in 21h, and 90.8% of total organic carbon was removed. Simultaneously, ammonium at an initial concentration of 40mg N/L was completely removed. The intermediates nitrate and nitrite accumulated in the early phase and declined in the later phase. The nitrogen balance analysis showed that 52.3% of removed nitrogen was finally transformed to intracellular nitrogen and 37.2% was converted to nitrogen gas. Ammonium was removed mainly through cellular assimilation and heterotrophic nitrification-aerobic denitrification. The detection of hydroxylamine oxidase, nitrate reductase and nitrite reductase activities demonstrated a coupled heterotrophic nitrifying-aerobic denitrifying pathway of strain PDB3. With the increase of phenol concentration, the inhibitory effect increased, leading to lower efficiency of ammonium removal.

heterotrophic nitrification；aerobic denitrification；phenol；ammonium

X703.1

A

1000-6923（2015）09-2644-06

2015-02-10

國家自然科學基金資助項目（51408396,51378330）；山西省青年科技研究基金（2013021023-3）

*責任作者, 教授, yuexiuping@tyut.edu.cn

王國英（1984-）,男,山西太原人,講師,博士,主要從事環境微生物及水污染控制研究.發表論文10余篇.