熒光素-Fenton體系熒光法測定中草藥抗氧化活性

趙二勞*, 王迎進, 賈 楠， 趙三虎, 范建鳳

(忻州師范學院化學系，山西忻州 034000)

自由基理論認為，生物機體疾病的發生發展與衰老是一個復雜的生物過程，它與自由基導致的機體細胞氧化損傷密切相關[1]?！H是目前已知的機體內活性氧中對生物體毒性最強、危害最大的一種自由基[2]。它可以通過電子轉移等反應，使機體內蛋白質、氨基酸、糖類、脂類和核酸等氧化損傷，引起機體組織細胞壞死或突變，導致機體衰老或發生腫瘤等諸多疾病[3 - 4]。因此，尋求自由基清除劑成為生命科學領域研究的熱點之一[5]，而中草藥的天然、豐富及低毒更受人們的青睞。

本文利用Fenton體系產生·OH，它能迅速氧化熒光素使其熒光猝滅，加入抗氧化劑使與熒光素作用的·OH量減少，導致體系熒光猝滅程度降低，據此建立了熒光法篩選抗氧化劑的新體系。應用該方法測定了金銀花、黃芪、甘草、葛根、菊花、黃柏、蒲公英、夏枯草和山楂9種中草藥提取物的抗氧化活性，方法簡便、可靠和實用。

1 實驗部分

1.1 主要儀器、試劑與材料

RF-5301 PC熒光分光光度計(日本，島津公司)；KQ-400KDE型高功率數控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FE20實驗室pH計(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

熒光素溶液：3.25 × 10-2mmol/L；FeSO4溶液：2.64 mmol/L；H2O2：0.024%；抗壞血酸溶液：1.94 mmol/L；硫脲溶液：4.10 mmol/L；NH3-NH4CI緩沖溶液：pH=10.5。實驗試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。

所用中草藥均購于當地藥店。

1.2 實驗方法

1.2.1激發波長與發射波長的確定在10 mL比色管中，依次加入0.3 mL NH3-NH4CI緩沖溶液(pH=10.5)，0.5 mL 濃度為3.25×10-2mmol/L熒光素溶液，2.0 mL濃度為 2.64 mmol/L FeSO4溶液，2.0 mL濃度為0.024%H2O2，二次蒸餾水定容至刻度，搖勻。反應10 min后，熒光掃描確定其最大激發波長和發射波長。

1.2.2·OH的測定取兩支10 mL比色管，按1.2.1節的方法加入試劑(一支加Fenton試劑，一支不加)，以實驗確定的發射波長為測定波長，分別測定加與不加Fenton試劑體系的熒光強度為F、F0，并計算△F=F0-F，則可間接求得·OH產生量。

1.2.3抗氧化劑對·OH清除率的測定按文獻方法[5]測定抗氧化劑對·OH清除率，其計算公式為：S=(Fs-F)/(F0-F)×100%。式中：S為對·OH的清除率；加入抗氧化劑Fenton體系熒光強度為Fs，F、F0意義同1.2.2。

1.2.4中草藥提取物抗氧化性的測定稱取粉碎過40目篩的中草藥金銀花、黃芪、甘草、葛根、菊花、黃柏、蒲公英、夏枯草和山楂等各2.0 g，分別置于100 mL錐形瓶中，加入60 mL 60%乙醇溶液，浸泡1 h后，在溫度40 ℃、超聲波功率320 W的條件下，提取40 min，提取液過濾定容至100 mL。此溶液相當于1 mL 提取液中含有20 mg中草藥溶出物[6]，即20 mg/mL。取0.2 mL按1.2.3方法測定。

2 結果與分析

2.1 熒光光譜

以490 nm為激發波長，在400～650 nm范圍內掃描熒光發射光譜，結果如圖1。由圖1可知，熒光素最大發射波長為515 nm。其熒光峰為曲線1，被·OH氧化后熒光峰為曲線3，加入抗氧化劑后體系熒光峰為曲線2。顯然，曲線1與曲線2之差△F1表示體系產生·OH的量；曲線2與曲線3之差△F2表示加入抗氧化劑使體系熒光猝滅降低的量，△F2與△F1之比，則反映抗氧化劑對·OH的清除能力。實驗以λex/λem= 490/515 nm為測定波長，激發與發射狹縫寬度均為5 nm。

圖1 熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra 1.Fluorescein+buffer;2.Fluorescein+buffer+Fe2++H2O2+sntioxidant;3.Fluorescein+buffer+Fe2++H2O2.

2.2 實驗條件的選擇

2.2.1酸度與緩沖溶液用量考慮到熒光素在酸性介質中基本不發熒光或熒光很弱，而堿性介質中發強熒光，熒光強度隨pH的增大而增大，當pH10時，熒光強度達到最大，并基本保持不變[7 - 9]，故選擇pH=10.5的緩沖溶液?？疾炀彌_溶液用量對體系△F的影響，在0.1～0.3 mL的范圍內，△F隨用量增大而增大，用量大于0.3 mL后，△F呈減少趨勢，實驗選作緩沖溶液用量為0.3 mL。

2.2.2試劑用量實驗結果表明，3.25×10-2mmol/L熒光素溶液適宜用量為0.5 mL， 2.64 mmol/L FeSO4溶液適宜用量為2.0 mL，0.024%H2O2適宜用量為2.0 mL。

2.2.3反應時間按實驗方法操作，每隔2 min測一次熒光強度，8 min內熒光強度隨時間的增加而下降，8～20 min內，熒光強度基本不變，實驗選取反應10 min后測定。

圖2 硫脲與抗壞血酸對·OH的清除率Fig.2 Scavenging percentage on ·OH of ascorbin acid (1) and thiourea (2)

2.3 抗氧化劑清除·OH的能力

抗壞血酸與硫脲是常用的抗氧化劑。在熒光素-Fenton體系中，分別加入不同量的抗壞血酸溶液(1.94 mmol/L)和硫脲溶液(4.10 mmol/L)，按實驗方法測定并計算清除率，以驗證本方法的有效性，結果如圖2?？梢娍箟难岷土螂逵昧颗c其對·OH的清除率有明顯的量效關系，表明該方法可用于篩選抗氧化劑。同時實驗測得9份2.5 mL硫脲溶液對·OH平均清除率S=28.81%，相對標準偏差(RSD)為1.56%，表明本實驗方法重現性良好。

2.4 中草藥的抗氧化活性

按1.2.4實驗方法測定9種中草藥提取物對·OH的清除率，每種中草藥平行測定3次，結果見表1?？梢?，所測9種中草藥均具有·OH清除能力，即具有抗氧化活性，相對而言，甘草、菊花、金銀花、葛根和山楂抗氧化活性更強。

表1 中草藥對·OH的清除率(n=3)

3 結論

建立了一種測定中草藥抗氧化活性的熒光分析新體系，應用該方法測定了金銀花等9種常見中草藥的抗氧化活性。實驗表明，該方法簡便快速，穩定可靠，具有較強的實用性，可用于抗氧化劑的篩選。同時實驗也表明，甘草、菊花、金銀花、葛根和山楂等中草藥具有較強的抗氧化活性，說明這些草藥中抗氧化物質含量較高，具有開發應用前景，值得進一步深入研究。