傳統發酵泡菜優勢微生物及其代謝特性

熊 濤，彭 飛，李 嘯，李軍波，關倩倩

（南昌大學生命科學與食品工程學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

傳統發酵泡菜優勢微生物及其代謝特性

熊 濤，彭 飛，李 嘯，李軍波，關倩倩

（南昌大學生命科學與食品工程學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

采用平板計數法分析泡菜發酵過程中主要微生物的變化規律，并利用高效液相色譜儀、pH計等儀器分析底物、代謝產物和pH值的變化。結果表明：我國傳統泡菜發酵過程中的主要微生物有乳酸菌、醋酸菌、酵母菌及霉菌；發酵7 d后，鹵水的最終pH值由初始的5.7降至3.2；蔗糖作為發酵體系內的主要碳源，在整個發酵過程中被大量代謝利用，發酵7 d后，蔗糖濃度由初始的74.4 mmol/L變為18.4 mmol/L；而葡萄糖和果糖在發酵過程中沒有明顯被利用，其濃度分別維持在28.1 mmol/L和23.2 mmol/L；檸檬酸與蘋果酸分別在24 h和12 h時達到最大濃度（3.4 mmol/L和8.9 mmol/L），然后下降，最后維持穩定，因此，發酵微生物對檸檬酸和蘋果酸有一定的利用能力；乳酸是發酵過程中的主要代謝產物并且呈現穩定的增長趨勢，其濃度由初始的5.6 mmol/L增長至149.6 mmol/L；乙酸和乙醇的產生則主要發生在泡菜的發酵前期。

泡菜；乳酸菌；發酵；代謝

泡菜是我國傳統特色發酵食品的典型代表之一，距今已有3 000多年的歷史［1］。我國傳統發酵泡菜的加工方式多以自然發酵為主，即利用附著在蔬菜表面的微生物進行發酵。在鹽水浸泡環境中，蔬菜本身攜帶的多種微生物（以乳酸菌為主）迅速繁殖，并利用以糖類為主的碳水化合物進行代謝活動，生成乳酸、乙醇、乙酸等代謝產物和多種揮發性風味物質，從而得到風味良好的成熟泡菜。對泡菜發酵過程中的優勢微生物和代謝物質進行分析，是深入研究我國傳統發酵泡菜的必經之路。國內外不少研究學者對自然發酵泡菜中的乳酸菌進行了分離鑒定及特性研究［2］。國內有學者對泡菜環境中的菌株進行了分離且采用分子生物學技術進行鑒定［3］：燕平梅等［4］對泡白菜鹵水中乳酸菌、酵母菌、霉菌和腸桿菌等優勢微生物進行了分離鑒定和抗菌特性的研究；張偉［5］研究了自然發酵泡菜過程中主要化學成分的變化以及乳酸菌、酵母菌、霉菌等微生物菌落長勢變化；陳功等［6］對四川泡菜的揮發性成分和主體風味物質進行了分析研究。從已有的研究成果來看，對傳統發酵泡菜的微生物動態變化的研究多見于乳酸菌，酵母菌和霉菌則較少，且未發現對泡菜中的醋酸菌進行分離計數的研究；而在代謝物分析方面，已有的研究主要集中在對自然發酵泡菜的還原糖和總酸含量的變化進行監測及對揮發性風味物質進行分析。本實驗利用不同的選擇性培養基及鑒定方法，對我國傳統發酵泡菜發酵過程中優勢微生物（乳酸菌、酵母菌、醋酸菌和霉菌）進行平板分離計數，并使用高效液相色譜技術（high performance liquid chromatography，HPLC），對發酵過程中的多種糖類及有機酸變化進行分析，從而明確泡菜在自然發酵過程中優勢微生物的菌系變化、代謝底物和代謝產物的含量變化，為進一步揭示我國傳統發酵泡菜發酵過程中多菌種協同發酵的機理提供科學的理論依據。

1　材料與方法

1.1材料、培養基與試劑

圓白菜、食鹽、冰糖、生姜、大蒜、干辣椒、花椒等購于當地市場。

乳酸菌分離計數培養基：MRS培養基，配制方法參照GB 4789.35—2010《食品衛生微生物學檢驗 食品中乳酸菌檢驗》。酵母菌及霉菌分離計數培養基：虎紅瓊脂，購于北京奧博星公司。醋酸菌分離計數培養基：醋酸菌固體培養基［7］。

氯化鈉、氫氧化鈉、碳酸鈣、無水乙醇、氯化鐵、濃硫酸（均為分析純） 上海國藥集團化學試劑公司；蔗糖、葡萄糖、果糖、乙醇、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、丙酮酸（均為分析標準品） 美國Sigma公司。

1.2儀器與設備

Agilent 1260型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；Aminex-87H色譜柱 美國伯樂公司、TG-16W微量高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；YXQ-LS-50SⅡ/75SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；DNP-9272型生化培養箱上海精宏實驗設備有限公司；Airtech生物安全柜 蘇凈集團安泰公司；PHS-25型pH計 上海精密科學儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1傳統泡菜的制作工藝及配方

表1　泡菜配方Table1 Formulation of Chinese sauerkraut

1.3.2取樣

泡菜入壇后，0～7 d內，每隔12 h，取發酵液進行代謝產物、pH值的測定以及優勢微生物的分離計數。

1.3.3優勢微生物的分離計數

無菌條件下，取1 mL發酵液于裝有9 mL無菌生理鹽水的試管中，充分搖勻，制成1：10稀釋菌懸液，然后按照每級10 倍的次序梯度稀釋。選擇3 個合適梯度，分別涂布于MRS培養基置于37 ℃培養48 h、虎紅培養基和醋酸菌固體培養基置于30 ℃培養3～5 d后計數，每個梯度做2 個平行樣。

1.3.4發酵液中糖和有機酸的分析

發酵液經離心（12 000 r/min，10 min）后，取上清液過0.22 μm濾膜，得到濾液用于高效液相色譜分析。色譜條件：進樣量20 μL，流動相為6 mmol/L硫酸溶液，流速為0.5 mL/min，溫度45 ℃，紫外檢測器檢測波長205 nm。以保留時間定性，以峰面積定量。示差折光檢測器檢測糖醇（蔗糖、葡萄糖、果糖、乙醇）含量，紫外檢測器檢測有機酸（檸檬酸、蘋果酸、乳酸、乙酸）含量。

2　結果與分析

2.1發酵期內發酵液pH值的變化

圖1　發酵過程中pH值的變化Fig.1 Changes in pH during the fermentation

由圖1可知，傳統發酵泡菜發酵過程中pH值呈下降趨勢。發酵前24 h，pH值即由5.7迅速降至4.2；發酵第2天pH值下降速率放緩，從4.2降至3.9；發酵進入第3天，pH值持續下降，并在進入第5天后趨于平穩，發酵結束時pH值降至3.2。

泡菜發酵啟動后，圓白菜中的蘋果酸和檸檬酸等有機酸滲出到鹵水中，同時腸膜明串珠菌、糞腸球菌等乳酸球菌迅速繁殖并代謝產酸，造成了pH值在發酵初期的快速下降。乳球菌的代謝活動會因低pH值環境的影響而受到抑制［8］，從而導致菌數和產酸量的減少，推測這是造成發酵第2天pH值下降速率變緩的主要原因。發酵進入第3天后，乳桿菌大量繁殖并產酸，使得泡菜發酵液pH值進一步降低。在整個發酵期內，乳酸菌代謝產生的有機酸是發酵液pH值下降的主要原因。

2.2發酵期內優勢微生物的動態變化

圖2　發酵過程中優勢菌數的變化Fig.2 Changes in microbial counts during the fermentation

傳統發酵泡菜發酵過程中乳酸菌、酵母菌、醋酸菌和霉菌的菌數變化如圖2所示。隨著發酵的進行，乳酸菌的數量快速增長，并保持穩定至發酵終點。醋酸菌的數量在發酵第1天持續上升至最高值5.2 （lg（CFU/mL）），之后在發酵的1～1.5 d內，緩慢下降至4.9 （lg（CFU/mL））；接著在1.5～3 d內，菌數迅速下降，至檢測不出。酵母菌和霉菌在泡菜發酵過程中表現出相似的變化規律：發酵第1天數量逐步升高至最大值，并在此后持續降低。不同的是，霉菌在發酵2.5 d時未能檢出，酵母菌于發酵3 d后未能檢出。

發酵啟動后，原先附著于圓白菜上的微生物游離于發酵液中，從而造成發酵初始階段鹵水中含有不同數量的微生物。由于泡菜發酵環境中碳源充足（投入的冰糖和圓白菜本身所含糖類的浸出），4 種監測的微生物均在發酵第1天生長迅速。從數量上看，乳酸菌是主導泡菜自然發酵的優勢微生物。乳酸菌具有良好的酸耐受性，在發酵終點時其數量幾乎沒有降低。泡菜發酵前期，壇內氧氣的消耗和異型發酵乳酸菌產生的二氧化碳制造了厭氧環境；而醋酸菌是嚴格好氧菌，推測厭氧環境的形成是其在發酵3 d后消失的主要原因。酵母菌和霉菌同樣在發酵進行3 d后完全消失，主要原因則可能是pH值的降低，另外厭氧環境不利于霉菌的生存。在泡菜發酵中，醋酸菌產生的醋酸給予泡菜一定的香氣，同時醋酸與乙醇形成酯類也可以增加香氣。霉菌則會消耗體系中的糖分、蛋白質等營養物質并產生臭味和亞硝酸等有害物質，故其大量繁殖會影響泡菜的品質［9-10］。

2.3發酵期內主要代謝底物含量的變化

蔗糖、葡萄糖和果糖是泡菜發酵體系中的主要碳源，主要來源于加入的冰糖和蔬菜中本身含有的少量糖類。檸檬酸和蘋果酸是存在于蔬菜中的有機酸類，其中檸檬酸對泡菜中香氣的產生很重要，且有文獻報道檸檬酸和葡萄糖在乳酸菌的代謝中存在協同代謝作用［11］；蘋果酸的代謝對泡菜質量的穩定也有重要的意義［12］。

圖3 發酵過程中主要代謝底物濃度的變化Fig.3 Changes in substrate concentrations during the fermentation

圖3為上述5 種底物在泡菜發酵過程中的代謝變化趨勢。在初始發酵過程中，蔗糖被顯著代謝，呈現急劇下降趨勢；此后，其下降趨勢較發酵前期顯得較為緩慢。蔗糖作為發酵體系中含量最多的糖，可以被多種微生物代謝利用。異型乳酸發酵的腸膜明串珠菌可能具有一種特殊的水解酶［13-14］，對蔗糖有良好的代謝能力且主導著自然發酵泡菜的前期發酵過程；酵母菌和霉菌對蔗糖也有較好的代謝能力，它們在前期的迅速增長需要大量碳源，從而導致蔗糖的急劇下降。隨著發酵過程中pH值的不斷下降，腸膜明串珠菌、酵母菌和霉菌由于較弱的耐酸性而消亡，而耐酸性較強的同型乳酸發酵菌株主導了泡菜的中后期發酵過程，其中植物乳桿菌［8］是主導中后期發酵的主要菌株。植物乳桿菌較腸膜明串珠菌對蔗糖的利用能力差，但因發酵后期其活菌數仍較高，故在發酵后期蔗糖的利用較前期下降速率稍緩。

葡萄糖和果糖含量在發酵過程中始終表現為上升趨勢。該現象與純菌種發酵中兩種單糖含量都呈現先上升后下降的趨勢截然不同［15］，其原因一方面可能是由于酵母菌的存在，其具有蔗糖水解酶，從而使乳酸菌對蔗糖的利用顯得較容易，另一方面由于發酵過程中蔬菜組織不斷軟化也會導致泡菜組織的糖滲出到發酵液中而使得葡萄糖與果糖含量呈上升趨勢。

檸檬酸和蘋果酸在發酵過程中表現出了相似的變化趨勢，均在發酵前期小幅度上升，然后緩慢下降，最終趨于平穩。檸檬酸作為風味物質的前體，其代謝產物對泡菜的風味存在重要的意義；另外，其與糖存在協同代謝作用，這樣就避免了酵母［16］的二次發酵。蘋果酸被代謝產生乳酸，增加了泡菜發酵初期的酸度，對泡菜的質量有一定的意義。

2.4主要代謝產物含量的變化

乳酸是泡菜發酵的主要有機酸，其含量直接影響泡菜中菌系的穩定性。乙酸作為異型乳酸發酵菌株的代謝產物之一，適量的乙酸［17］可以有效提高泡菜的感官性質。乙醇主要來源于酵母菌的代謝，乙醇的變化可以有效地反映酵母在泡菜發酵過程中的活動。

圖4 發酵過程中主要代謝產物濃度的變化Fig.4 Changes in metabolic products during the fermentation

圖4描述了3 種主要代謝產物在泡菜發酵過程中的變化趨勢。在發酵初期，乳酸的含量緩慢升高，隨后其含量迅速增加，直至后期緩慢上升。而乙酸的含量在整個發酵過程中都表現出較緩慢地增加，且發酵前期的變化要較中后期明顯。乙醇的增加主要出現在前4 d，其后趨于平穩。

在發酵前期雖然有大量的蔗糖被利用，但乳酸的含量卻緩慢增加，一方面，由于有真菌的存在，相當一部分的蔗糖被利用但是不產乳酸，另一方面，前期主導發酵的是異型乳酸發酵的乳酸菌，與同型乳酸發酵菌相比，其消耗等量蔗糖卻只能產生更少量的乳酸［15］。發酵中期，產酸能力較強的同型乳酸發酵菌大量生長繁殖并主導泡菜的發酵，使得泡菜液中乳酸含量在發酵中期迅速增加。在發酵后期，雖然蔗糖被穩定地利用，但此時泡菜中的一些環境因素（如高濃度酸，低pH值）已經在一定程度上對乳酸菌有了抑制作用，乳酸菌需要消耗更多的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）來維持細胞內的pH值穩定，同時也調節自身的代謝活動產生更少的乳酸。乙酸是異型乳酸發酵菌株通過異型乳酸發酵途徑的產物之一［18］，其變化主要源于乳酸菌的產生和泡菜組織的滲出，前期異型乳酸菌的迅速增長使乙酸含量有了明顯增加，隨著酸度的升高，異型乳酸菌由于較弱的耐酸性而死亡，乙酸的變化主要由泡菜組織滲出而顯得變化不大。在發酵前期，pH值較適宜酵母的生長時，酵母菌和異型乳酸發酵菌株利用蔗糖產生較多的乙醇，發酵3 d后，由于pH值較低，酵母菌和異型乳酸發酵菌株逐漸死亡，導致乙醇的量也趨于穩定。

3　結 論

通過對我國傳統自然發酵泡菜的研究發現，在發酵前2 d，乳酸菌活菌數迅速升高，之后趨于穩定；酵母菌、霉菌和醋酸菌在發酵前期都有較明顯的生長，但中期后逐漸消亡；泡菜液pH值在發酵的初始為5.7，隨著發酵進行急劇下降，發酵末期達到3.2；蔗糖作為主要的碳源在整個發酵過程中都明顯地被代謝，然而作為碳源的葡萄糖和果糖含量沒有明顯變化；檸檬酸和蘋果酸在發酵過程中也可被代謝利用；乳酸是乳酸菌在泡菜發酵中的主要產物，其含量在發酵過程中穩定地上升；乙醇和乙酸的生成主要在泡菜發酵的前期。在自然發酵泡菜中微生物的變化及其代謝特性的研究基礎上，可進一步研究單菌種發酵泡菜及多菌種發酵泡菜的控制機理，進而提升對我國泡菜的理論研究及工業生產水平。

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Changes and Metabolic Characteristics of Main Microorganisms during Chinese Sauerkraut Fermentation

XIONG Tao， PENG Fei， LI Xiao， LI Junbo， GUAN Qianqian
（State Key Laboratory of Food Science and Technology， College of Life Science and Food Engineering， Nanchang University，Nanchang 330047， China）

Laboratory scale fermentations of Chinese sauerkraut were performed to investigate the changes in microorganisms， the pH of the brine， the substrates and the metabolic products. The main microorganisms were monitored using selective agar medium. The substrates and the metabolic products were analyzed by high performance liquid chromatography. The results evidenced that the main microorganisms included lactic acid bacteria， acetic bacteria，saccharomycetes and mycete. The pH was reduced from 5.7 to 3.2 after 7 days of fermentation. The utilization of sucrose during the fermentation was strong， as indicated by a reduction from 74.4 to 18.4 mmol/L. However， glucose and fructose were hardly metabolized by the cells and their final concentration were 28.1 mmol/L and 23.2 mmol/L， respectively. Critic acid and malic acid were easily metabolized during the fermentation and their maximum concentrations， （3.4 and 8.9 mmol/L，respectively） were observed after 24 and 12 h of fermentation followed by a decline until reaching a plateau. As the major metabolic product， lactic acid was steadily increased from 5.6 to 149.6 mmol/L during the fermentation； moreover， the levels of ethanol and acetic acid increased in the early stage of the fermentation process.

Chinese sauerkraut； lactic acid bacteria； fermentation； metabolism

TS201.3

A

1002-6630（2015）03-0158-04

10.7506/spkx1002-6630-201503030

2014-04-09

“贛鄱英才555工程”領軍人才培養計劃項目（18000063）；江西省教育廳高?？萍悸涞赜媱濏椖浚ㄚM財教［2011］243號）；國家重點實驗室自由探索課題（SKLF-ZZB-201309）；國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2011AA100904）

熊濤（1970—），男，教授，博士，研究方向為益生菌及大宗果蔬高值化利用。E-mail：xiongtao0907@163.com