毛細管電泳技術對手性藥物西酞普蘭的拆分方法研究

劉慧青， 李愛梅， 徐中其

(東華大學化學化工與生物工程學院，上海 201620)

手性是自然界很多化合物具有的普遍特性。臨床上常用的藥物中高達62%是手性藥物，大多以外消旋體形式供藥。通常來說，手性藥物的對映異構體在人體內大多情況下會表現出不同的療效和毒理性，對映體之一具有活性和治療性，另外一個則是非活性，甚至具有毒副作用[1]。因此，拆分并測定手性藥物異構體成為臨床學和生命科學中的一個重要問題。常見的藥物手性拆分方法有經典結晶法、動力學拆分法和色譜分離法等。近年來色譜分離法已成為藥物分析檢驗中應用極為廣泛的拆分方法[2,3]，但存在費用昂貴和分析時間長等缺點。毛細管電泳(CE)直接拆分手性對映體，憑借其分離效率高、分析時間短、溶劑消耗少、方法靈活和僅需微量樣品等優點得到迅速發展，被日益廣泛的應用于手性藥物拆分領域[4 - 6]。

圖1 CIT兩對映體的結構式

選擇性5-羥色胺(5-HT)再攝取抑制劑(Selective Serotonin Reuptake Inhibitor,SSRI)是一類抗抑郁藥的總稱，主要用于治療抑郁癥、焦慮癥、強迫癥及神經性厭食癥。西酞普蘭(Citalopram，CIT)是SSRI的一種(結構式見圖1)，其對5-HT再吸收抑制作用強、選擇性高[7]。CIT以消旋體化合物的形式存在，藥理學研究證實，CIT的(S)-對映體依他普侖(Escitalopram)是消旋體CIT產生5-HT再攝取抑制作用的原因，依他普侖在體內對5-HT再攝取的抑制作用是(R)-CIT的167倍。單一對映體形式的依他普侖已上市，因此，開發高靈敏的手性分析方法具有現實意義。目前，CIT的CE手性拆分方法中使用的拆分試劑主要是糖類物質，特別是環糊精及其衍生物[8,9]。Mandrioli等以1%(m/V)磺化β-環糊精和0.05%(m/V)β-環糊精為手性拆分劑，應用CE技術開發了CIT手性拆分方法，6 min內實現手性分離，檢測限0.15 μg/mL[10]。Sungthong等將0.5 mg/mLβ-環糊精和22 mg/mL磺化β-環糊精添加到緩沖液中，應用CE技術開發了檢測(S)-CIT中雜質組分((R)-CIT、(R)-Citadiol、(S)-Citadiol)的方法，各雜質的定量限均為2.5 μg/mL[11]。本文采用磺化β-環糊精為手性選擇劑，對CIT光學異構對映體S-CIT和R-CIT進行CE法拆分，考察了各實驗條件對拆分效果的影響，并初步探討了手性試劑羥乙基β-環糊精、β-環糊精和磺化β-環糊精的拆分機理。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

P/ACE MDQ型毛細管電泳系統(Beckman)。

CIT消旋體購自上海麥倉生物科技有限公司；來士普成品藥((S)-CIT·HBr)購自倫貝克公司(丹麥哥本哈根)。β-環糊精(β-CD)、甲基β-環糊精(M-β-CD)、羥乙基β-環糊精(HE-β-CD)、羧甲基β-環糊精(CM-β-CD)和磺化β-環糊精(S-β-CD)，均購自Sigma-Aldrich；檸檬酸、H3PO4、NaH2PO4和Na2PO4、NaOH，均購自中國國藥集團。試劑均為分析純。實驗用水為超純水。

1.2 溶液的配制

儲備溶液：準確稱取一定量的消旋體西酞普蘭，用超純水定容，配成0.20 g/L標準儲備液，將儲備液置于冰箱中保存，每次使用之前用超純水稀釋到相應的濃度。緩沖溶液：配制檸檬酸緩沖溶液，按照需要加入不同量的檸檬酸和手性拆分劑，用1 mol/L NaOH溶液調節pH，最后定容。樣品溶液：取2粒依他普侖藥片(來士普，標準規格為10 mg(S)-CIT·HBr/tablet)，稱重為0.2590 g，將藥片用研缽研碎，稱取0.1208 g依他普侖用約60 mL超純水溶解，超聲10 min，定容至100 mL。12 000 r/min離心10 min后，取上清液過濾后，備用(其中(S)-CIT·HBr的含量為100.0 μg/mL)。

1.3 毛細管電泳操作條件

彈性石英毛細管柱總長度為50 cm，其有效長度40 cm，內徑為75 μm(河北永年銳灃色譜器件有限公司)。毛細管首次使用時依次用甲醇沖洗10 min，超純水沖洗5 min，1 mol/L NaOH溶液沖洗30 min，超純水沖洗5 min。每次實驗前依次用超純水沖洗3 min，緩沖溶液沖洗3 min，再進行樣品的分離。

檢測條件：樣品濃度為10 μg/mL，采用0.5 psi持續5 s進樣，分離電壓+20 kV。毛細管溫度采用液冷方式控制在25 ℃，紫外檢測波長設定為205 nm。

2 結果與討論

2.1 電泳分離條件的優化

2.1.1緩沖溶液的選擇本實驗在固定手性拆分劑S-β-CD為0.04%(m/V)的條件下，研究了檸檬酸、Na2HPO4-H3PO4和Tris-H3PO4緩沖溶液對CIT的兩個對映體分離效果的影響。結果發現，在檸檬酸緩沖體系中，遷移時間較快，且有較好的分離度和峰形，分離效果較理想。選擇檸檬酸體系作為緩沖溶液。

2.1.2緩沖溶液pH值的選擇毛細管電泳中緩沖溶液pH值是非常重要的參數之一。本實驗考察了pH=4～7范圍內，CIT對映體分離的變化，結果見圖2。分離度(RS)隨著pH的減小而增大，這可能是pH減小使得毛細管中的電滲流淌度降低，從而延長對映體與手性拆分劑在毛細管內的作用時間，最終提高對映體的RS。但是當pH小于5.50時，緩沖能力急劇降低且分析時間延長?？紤]到pH為5.50時已有足夠的RS，最終確定檸檬酸緩沖溶液的pH值為5.50。

2.1.3緩沖溶液濃度的選擇實驗固定pH=5.50和手性拆分劑S-β-CD為0.04%，考察了檸檬酸緩沖溶液濃度在10～50 mmol/L范圍內變化對分離效果的影響(圖3)。結果表明，增大緩沖溶液濃度會使毛細管電滲流下降，但同時CIT有效淌度增大且RS降低，因此應盡量選擇較低的濃度?？紤]到檸檬酸濃度為10 mmol/L時緩沖能力較差，最終優化的緩沖溶液濃度為20 mmol/L。隨檸檬酸濃度的增大，CIT有效淌度增大而兩個對映體的分離度降低。其原因可能是CIT兩個對映體和拆分劑動態結合后的兩非對映體與檸檬酸發生了相互作用，增大檸檬酸濃度使非對映體有效淌度增大并減小了兩種非對映體的差異，從而導致其RS降低。

2.1.4手性拆分劑的選擇實驗考察了不同手性試劑對CIT兩對映體電泳分離的影響。分別采用環糊精衍生物(S-β-CD、M-β-CD、H-β-CD、HE-β-CD和CM-β-CD)、膽酸鹽(膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、去氫膽酸鈉、?；悄懰徕c)和糖肽類抗生素(萬古霉素、替考拉寧)作為手性拆分劑，改變拆分劑的濃度和緩沖溶液pH值，結果見圖4。實驗表明：四種膽酸鹽和兩種抗生素對CIT沒有拆分能力；只有部分環糊精衍生物對CIT具有手性拆分能力，其中拆分能力順序為：S-β-CD>HE-β-CD>H-β-CD。這很可能是由于HE-β-CD的側鏈長度大于H-β-CD，具有調節性更好的空腔，因此拆分能力更大；S-β-CD由于共軛作用的影響，使O具有更強的電負性，因此與雜原子形成的氫鍵更強；且CIT的呋喃環是剛性結構，因此O、F、N的位置相對固定，能和S-β-CD形成更強的氫鍵相互作用，進而S-β-CD表現出很強的手性拆分能力[12,13]。因此，選擇S-β-CD作為手性拆分劑。

圖2 pH值對手性拆分效果的影響

圖3 緩沖溶液濃度對手性拆分效果的影響

2.1.5手性拆分劑濃度的選擇手性藥物分離中，一般手性拆分劑的濃度越大拆分效果越好，即RS越大。本實驗在緩沖溶液中添加0.005%～0.1%(m/V)的S-β-CD，考察了拆分劑濃度對CIT手性分離的影響，結果如圖5所示。當緩沖溶液中S-β-CD濃度由0.005%增大到0.04%時，CIT的兩個對映體分離度逐漸變大；當S-β-CD濃度繼續增大至0.01%時，(S)-CIT和(R)-CIT分別在電滲流(EOF)前后出峰。這是因為CIT的pKa約為9.5，在pH=5.50的檸檬酸緩沖溶液中呈陽離子；而S-β-CD在該檸檬酸緩沖溶液中呈陰離子，兩者在電場中移動方向相反。因此CIT的兩個對映體與拆分劑S-β-CD動態結合后，使其有效淌度變小甚至反向。由于兩個對映體與拆分劑的平衡常數不同，當手性拆分劑濃度在一定范圍內時，使得兩個對映體與拆分劑S-β-CD動態結合后整體分別帶相反電荷，并在EOF兩側出峰。綜合考慮以上因素，本實驗選擇拆分劑濃度為0.04%，在此條件下CIT的兩對映體可以獲得較好的分離度。

圖4 手性拆分劑對手性拆分效果的影響

圖5 S-β -CD濃度對手性拆分效果的影響

2.2 方法學考察

2.2.1方法的重現性和檢出限在優化后的檢測條件下，將CIT兩個對映體連續5次進樣，考察方法的重現性和選擇性。(S)-CIT和(R)-CIT遷移時間的相對標準偏差(RSD)分別為0.8%、1.6%，峰面積的RSD分別為2.2%、2.9%；分離度(RS)為8.62。以信噪比(S/N)=10計算出兩個對映體的定量限(LOQ)均為0.3 mg/L，以S/N=3計算檢出限(LOD)均為90 μg/L。

2.2.2方法的線性關系用對映體濃度分別為0.050、0.10、0.25、0.50、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 mg/L的混合標準溶液，在上述優化后電泳條件下，對每個濃度重復進樣兩次，結果表明兩個對映體濃度在0.05～100 mg/L范圍內線性關系良好，其回歸方程分別為：(S)-CIT：Y=31.62X+12.92，R2=0.999；(R)-CIT：Y=32.24X+17.78，R2=0.998。

2.3 來士普藥片的分析

2.3.1對映體的定性及光學純度的測定通過向20 μg/mL消旋體CIT中添加0～50 μg/mL不同濃度的(S)-CIT，在優化檢測條件下對該系列樣品進行檢測。結果如圖6所示，隨(S)-CIT濃度的增加，第一個峰逐漸增大，表明遷移時間短的是(S)-CIT，與文獻報道相符。

以依他普侖藥片經處理后的溶液(按標準規格計算，(S)-CIT·HBr為100 μg/mL)為樣品，對該樣品進行分離測定(圖7)。結果表明，藥品中(R)-CIT的含量為總量的1.27%，對映體過剩百分數為97.5%，符合要求。

圖6 對映異構體的定性

圖7 藥品光學純度的測定

2.3.2含藥量和回收率將處理好的樣品(100 μg/mL(S)-CIT·HBr)稀釋10倍，在優化實驗條件下對該樣品進行分析(重復3次)，并通過標準工作曲線計算出濃度，最后計算實際含藥量為標準規格。繼而向該稀釋樣品中添加20.0 μg/mL CIT(重復3次)，測定兩個對映異構體的回收率，結果見表1。

表1 來士普成品藥中的含藥量及回收率(n=3)

"ND":not detected.

3 結論

以S-β-CD作為手性選擇劑對西酞普蘭對映體進行毛細管電泳拆分，通過對分離條件的優化，建立了具有分析時間短、重現性好和靈敏度高等特點的毛細管電泳拆分方法。該方法減少了拆分劑磺化β-CD的使用濃度，具備了更加靈敏的定量檢測能力，更加適合于西酞普蘭對映體的拆分分析。