急性肺損傷小鼠脾臟樹突狀細胞動態變化研究

劉軍 張朋書 徐靜媛 楊毅 邱海波

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2015.03.003

基金項目：國家自然科學基金（81070049，81170057）;江蘇省“科教興衛工程”醫學重點學科項目 （889-KJXW11.3）;衛生公益性行業科研專項經費項目 （201202011）;國家臨床重點?？平ㄔO項目（2100299）;中國博士后科學基金資助項目（2013M542578）;江蘇省博士后科研資助項目（1301005A）;江蘇省高?？蒲袆撔掠媱?（CX09B-066Z）;江蘇省自然科學基金（BK20141175）;江蘇省衛生廳科技項目（Z201414）;蘇州市科技計劃項目 （SYS201251）;南京醫科大學哲學社會科學發展專項（2013NJZS50）

作者單位：215001 蘇州，南京醫科大學附屬蘇州市立醫院東區重癥醫學科 （劉軍）;東南大學附屬中大醫院重癥醫學科 （張朋書、徐靜媛、楊毅、邱海波）

通信作者：邱海波，Email：haiboq2000@gmail.com

【摘要】目的 研究脂多糖 （LPS） 誘導急性肺損傷 （ALI） 小鼠脾臟樹突狀細胞 （DC） 數量改變和成熟狀態，探討ALI小鼠脾DC變化規律。方法 C57BL/6小鼠36只，隨機（隨機數字法）分為2組。①對照組 （Con）：小鼠氣管內注射PBS 30 μL;②ALI組 （ALI）：氣管內注射脂多糖 （LPS） 2 mg/kg復制ALI模型。后又按注射LPS或PBS 后6、12、24 h 三個時間點各分成三組，每組6只小鼠。光鏡觀察肺組織病理改變，測定肺損傷評分，計算肺濕質量/體質量比 （LW/BW），酶聯免疫吸附法 （ELISA） 檢測肺組織勻漿中白細胞介素-6 （IL-6） 的含量，以反映肺組織炎癥損傷程度。流式細胞儀 （FCM） 檢測脾單細胞懸液中DC比例及表達CD80、MHC Ⅱ水平。結果 ALI組小鼠6、12、24 h時點的肺LW/BW均明顯高于對照組 （P<0.05）。病理檢測示ALI組小鼠肺泡間隔增寬、充血、出血及大量炎性細胞浸潤等急性肺損傷病理改變。ALI組肺損傷評分及肺組織IL-6水平均顯著高于對照組 （P<0.05）。FCM檢測顯示，與對照組相比，ALI組小鼠脾臟DC呈一過性升高，ALI組12 h時點脾臟DC升高至 （1.92±0.25）%，顯著高于對照組（P<0.01），24 h時點降至基線水平 （0.96±0.21）%。與對照組相比，ALI組脾臟DC表達CD80顯著增加 （P<0.01）;與ALI組6 h相比，ALI組12 h和24 h脾臟DC表達CD80顯著升高 （P<0.05）。ALI組與對照組及ALI組各時間點脾臟DC表達MHC Ⅱ的差異無統計學意義 （P>0.05）。 結論 ALI早期脾臟DC存在一過性升高，伴功能呈成熟狀態，脾臟DC可能參與ALI炎癥損傷的發生發展。

【關鍵詞】急性肺損傷;急性呼吸窘迫綜合征;樹突狀細胞;脾臟;炎癥

Dynamic alteration of spleen dendritic cells in acute lung injury mice

Liu Jun， Zhang Pengshu， Xu Jingyuan， Yang Yi， Qiu Haibo.

Department of Critical Care Medicine， Suzhou Hospital， Nanjing Medical University， Suzhou 215001， China

Corresponding author： Qiu Haibo， Email： haiboq2000@gmail.com

【Abstract】Objective To investigate the kinetics and phenotype of spleen dendritic cells （DC） in lipopolysaccharide （LPS） -induced acute lung injury （ALI） mice. Methods Thirty-six C57BL/6 mice were randomly（random number） divided into two groups： control group and ALI group. Spleens were harvested at the following intervals of 6， 12， and 24 h after LPS or PBS administration. Lung wet weight /body weight ratio （LW/BW） was recorded to assess lung injury. Meanwhile， pathological changes were examined under optical microscope. The IL-6 level in the lung was measured by using ELISA （enzyme-linked immuno sorbent assay）. The DC in the spleen was measured by flow cytometry （FCM）. Results （1） LPS-ALI resulted in a significant increase in LW/BW ratio. （2） Histologically， extensive alveolar wall thickening resulted from edema， severe hemorrhage in the interstitium and alveolus， and marked and diffuse interstitial infiltration with inflammatory cells were observed in the ALI group. （3） Meanwhile， the levels of IL-6 in lung tissue were significantly increased in the LPS-induced ALI mice. （4） LPS-induced ALI led to divergent kinetics of spleen DC in ALI mice. In ALI mice， spleen DC only showed a transient increase at 12 h. （5） All DC within spleens had a modest maturation in ALI mice. Conclusions LPS-induced ALI provokes a transient increase as well as modest maturation of spleen DC.

【Key words】Acute lung injury; Acuet respiratory distress syndrome; Dendritic cells; Spleen; Inflammation

急性肺損傷 （acute lung injury， ALI） 及其嚴重形式急性呼吸窘迫綜合征 （acute respiratory distress syndrome， ARDS） 是嚴重感染、創傷、休克等導致的急性難治性呼吸衰竭。全身性感染（sepsis）是ALI最常見的原因，占ALI病因50%以上[1]。近年來，盡管呼吸支持治療取得長足進步，但是ALI病死率依然高達40%[2]。目前認為失控的肺部炎癥反應是ALI發生發展的根本機制[3]。樹突狀細胞 （dendritic cell， DC） 是機體功能最為強大的抗原提呈細胞，具有獨特的激發初次免疫應答的能力[4]。研究顯示，肺常規DC在介導ALI肺炎癥反應中發揮重要的作用[5]。DC在組織中接受抗原刺激后遷移至局部免疫器官如脾臟、淋巴結的T細胞區，啟動免疫應答[6]。脾臟作為機體最大的外周免疫器官，有大量研究證實脾臟DC參與全身性感染的炎癥激活和后期的免疫抑制[7-11]。然而，對于ALI時脾臟DC變化尚不清楚。本實驗通過復制LPS-ALI小鼠模型，應用流式細胞術觀察脾臟DC數量和功能狀態，探討ALI小鼠早期脾臟DC變化規律，為深入了解ALI的炎癥反應機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及實驗分組

1.1.1 實驗動物 SPF級C57BL/6小鼠36只，雄性，6～8周齡，體質量18～22 g，由南京軍區總醫院實驗動物中心提供。常規食水喂養并維持正常晝夜節律，穩定72 h后開始實驗。本研究動物實驗方案符合美國實驗動物管理與使用指南的要求。

1.1.2 主要試劑和儀器 LPS和膠原酶V購自Sigma-Aldrich公司。小鼠CD11c、CD11b、MHC Ⅱ、CD80及同型對照單克隆抗體購自eBioscience公司。小鼠IL-6 ELISA kit由上海依科賽生物有限公司提供。流式細胞儀為美國BD公司產品（BD FACSCaliburTM）。

1.1.3 實驗分組 C57BL/6小鼠稱質量后，將36只C57BL/6小鼠隨機（隨機數字法）分為2組。① 對照組 （Con）：氣管內滴入與LPS等體積的PBS;（2） ALI組 （ALI）：氣管內滴入LPS 2 mg/kg復制LPS-ALI模型。后又按注射LPS或PBS 6、12、24 h三個時間點各分成3組，每組6只小鼠，至觀察6、12、24 h后處死小鼠，留取脾待檢。

1.2 ALI模型制備

小鼠稱質量，戊巴比妥鈉 （50 mg/kg） 腹腔注射麻醉，仰臥固定于實驗臺，頸部皮膚消毒，切開皮膚，逐層分離皮下組織，暴露氣管。氣管內注入LPS 2 mg/kg （溶于30 μL PBS中，對照組注入等體積的PBS），縫合切口。手術完畢后迅速將動物直立、旋轉，使液體在肺內分布均勻。動物清醒后常規飼養。小鼠LPS-ALI模型建立成功標準：肺間質充血、水腫，肺泡間隔明顯増寬，肺間質和肺泡腔內有大量炎細胞浸潤、出血，大量肺泡萎陷[12]。

1.3 脾單細胞懸液制備

小鼠處死，無菌打開腹腔，應用機械法并裂解紅細胞將脾臟制成單細胞懸液[13]。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 肺濕質量/體質量 （LW/BW） 測定 處死小鼠后，留取肺組織。用吸水紙將肺組織表面水分吸盡并清除血漬后，稱質量并計算肺組織LW/BW。

1.4.2 肺組織HE染色及肺損傷評分 肺組織固定、石蠟包埋、HE染色，光鏡下觀察肺組織損傷程度，采用Smith法進行肺損傷半定量評分[14]。

1.4.3 ELISA檢測肺組織IL-6質量濃度 取右下肺組織制備肺組織勻漿，ELISA檢測IL-6質量濃度嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.4.4 流式細胞儀檢測脾DC數量及功能狀態 脾單細胞懸液在顯微鏡下行細胞計數，調整細胞數為1×10⁶/mL，分別加入單克隆抗體FITC-CD11c，Percp-Cy5.5-CD11b，PE-MHC Ⅱ及APC-CD80，室溫下避光孵育30 min，PBS洗滌后以1%多聚甲醛固定，4 ℃避光保存，24 h內上機檢測。各樣本均設相應的同型對照管作為陰性對照。樣本應用流式細胞儀FACSCalibur^TM（BD公司） 檢測，用Cellquest軟件（美國BD公司）分析數據。

參照文獻[15-16]以CD11c+CD11b+細胞占脾單細胞數量百分比反映脾DC數量。分析表面表達CD80、MHC Ⅱ的DC比例，反映DC功能狀態和成熟程度。

1.5 統計學方法

采用SPSS 16.0軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示。兩組間比較采用成組t檢驗，多組間比較采用單因素方差（LSD-t法）分析，方差不齊時采用Mann-Whitney U及Dunnetts T3檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 ALI小鼠肺炎癥損傷變化

肺LW/BW反映肺炎癥損傷程度[17]。ALI組小鼠6、12、24 h LW/BW均明顯高于對照組相應時間點LW/BW （P<0.05），但ALI組各時間點差異無統計學意義 （P>0.05），見表1。病理學檢查顯示對照組小鼠肺泡間隔均一，肺泡腔內未見明顯滲出液及炎性細胞浸潤;ALI組小鼠肺組織病理檢查見肺泡間隔明顯增寬、出血并有大量炎性細胞浸潤，見圖1。Smith肺損傷評分可半定量評估ALI肺炎癥損傷程度[14]。ALI組6、12、24 h肺組織病理損傷評分均明顯高于對照組相應時間點的肺損傷評分 （P<0.05），但ALI組各時間點差異無統計學意義 （P>0.05），見表1。ALI組6、12、24 h肺組織IL-6含量均明顯高于對照組相應時間點肺組織IL-6水平 （P<0.01）;與ALI組6 h和24 h相比，ALI組12 h肺IL-6水平顯著升高 （P<0.01）。見表2。

2.2 ALI小鼠脾DC數量動態改變

對照組小鼠6、12、24 h脾DC分別為（1.12±0.37）%、（1.16±0.34）%和（1.14±0.15）%。ALI小鼠6 h脾DC為（1.28±0.25）%，與對照組差異無統計學意義 （P>0.05）;ALI 組12 h脾臟DC顯著升高至 （1.92±0.25）%，明顯高于對照組 （P<0.01）;ALI小鼠24 h脾DC降至 （0.96±0.21）%，與對照組差異無統計學意義 （P>0.05）。與ALI組6 h和24 h相比，ALI組12 h脾DC數量顯著升高 （P<0.01）。見表3和圖2A、B。

2.3 ALI小鼠脾臟DC表達CD80水平

對照組6、12、24 h 脾DC表達CD80分別為（9.0±3.6）%、（10.1±3.6）%和（11.3±3.5）%。ALI組相應時間點脾DC表達CD80分別為 （25.2±4.7）%、（36.6±6.2）%和（43.9±10.5）%，明顯高于對照組 （P<0.01）。與ALI組6 h相比，ALI組12 h和24 h脾臟DC表達CD80顯著升高 （P<0.05）;但ALI組12 h和24 h脾臟DC表達CD80水平差異無統計學意義 （P>0.05）。見表4和圖2C、2D。

2.4 ALI小鼠脾臟DC表達MHC Ⅱ變化

對照組6 h、12 h和24 h脾DC表達MHC Ⅱ分別為 （84.9±8.6）%、（85.4±1.8）%和（82.2±6.6）%;ALI組小鼠相應時間點脾DC表達MHC Ⅱ 分別為 （88.9±1.5）%、（89.0±4.0）%和（86.5±9.5）%，與對照組差異無統計學意義 （P>0.05）;ALI組各時間點脾DC表達MHC Ⅱ水平亦差異無統計學意義 （P>0.05）。見表4和圖2E、F。

3 討論

ALI是感染、創傷和休克等導致的急性難治性呼吸衰竭，病死率高[1]。目前認為失控的炎癥反應是其發生的根本原因[3]。DC是功能最強大的專職抗原提呈細胞，廣泛分布于機體各組織，在啟動和調節免疫應答反應中發揮關鍵性作用[4]。小鼠DC通過誘導T、B、NK等調控免疫應答，并通過釋放細胞因子調節免疫反應的強度和時程[18]。近

期研究證實，肺DC在介導ALI肺炎癥反應中發揮重要的作用[5]。而脾臟作為機體最大的外周免疫器官，是發揮免疫應答效應的重要場所，其細胞組成、免疫調理因子的變化對機體整體免疫狀態起重要的調節作用[16]。研究ALI脾DC狀態有助于闡明ALI致病機制。

本研究利用氣管內注射LPS （2 mg/kg） 復制小鼠ALI模型，模擬肺部感染導致ALI的臨床過程。結果顯示，LPS注射后，小鼠肺組織LW/BW顯著升高，肺組織病理可見肺泡間隔增寬和肺泡間質內血管充血、出血及大量炎細胞滲出等ALI病理變化，Smith評分也顯示小鼠肺損傷評分顯著高于對照組，肺組織IL-6顯著升高，證實小鼠ALI模型復制成功。

本實驗應用流式細胞儀檢測脾單細胞懸液，結果發現從正常小鼠的脾臟分離出來的DC占1%左右，與既往研究結果基本一致[16]。本研究結果顯示，ALI小鼠脾臟DC呈一過性升高，12 h達高峰，24 h恢復基線水平。有研究顯示，小鼠靜脈注射LPS后，淋巴結中DC的數量在6 h內明顯升高，12～24 h達高峰，峰值較正常升高8～15倍，隨后DC大量凋亡而降至低于正常水平[19]。另有實驗利用全身性感染小鼠模型，發現脾臟DC數量明顯增加，36 h達高峰，然而48 h脾臟DC數量明顯減少，推測是免疫系統自身“負反饋”[20]。本實驗結果提示ALI小鼠脾臟DC與全身性感染小鼠變化趨勢基本一致，在12～36 h呈現峰值，隨后降至正?；蚋退?。略有不同的是，本研究觀察到ALI 小鼠脾臟DC在12 h達峰值，似略早于全身性感染小鼠 （12～36 h），原因尚不清楚，可能與不同模型選擇、免疫反應方式不全相同等因素有關。

DC成熟狀態也決定機體發生免疫反應的類型和程度。未成熟DC誘導免疫激活的能力很弱，成熟的DC具有誘導免疫激活T細胞的功能，改變DC的表型和功能將影響機體的免疫應答反應。筆者通過檢測DC表達CD80水平反映DC功能狀態和成熟程度，檢測DC表達MHC Ⅱ反映DCs抗原提呈功能和成熟狀態[21]。

本研究發現盡管ALI小鼠脾臟DC數量僅一過性升高，但在各觀察時間點脾臟表達CD80的DC均明顯升高，且隨觀察時間延長進一步升高，表明成熟的DC增多，且呈時間依賴性，與全身性感染小鼠早期脾臟DC功能變化基本一致，該變化也與ALI早期機體炎癥反應亢進過程相吻合[10-11]。然而，ALI時表達MHC Ⅱ的脾臟DC差異無統計學意義，均近90%左右，表示在靜息狀態和炎癥狀態下脾臟DC均有較強的抗原提呈能力，ALI小鼠脾臟DC表達MHC Ⅱ差異無統計學意義，不排除可能與DC高表達MHC Ⅱ有關。

總之，本研究發現ALI小鼠脾臟DC呈一過性增加，伴功能呈成熟狀態。脾臟DC可能參與ALI發生發展，而以脾臟DC為靶點調控ALI病程可能具有新的防治前景。

參考文獻

[1]Matthay MA， Ware LB， Zimmerman GA. The acute respiratory distress syndrome [J]. J Clin Invest， 2012，122（8）：2731-2740.

[2]Ferguson ND， Cook DJ， Guyatt GH， et al. High-frequency oscillation in early acute respiratory distress syndrome [J]. N Engl J Med， 2013，368（9）：795-805.

[3]邱海波， 黃英姿. 急性呼吸窘迫綜合征治療的進步[J]. 中華急診醫學雜志， 2011，20（2）：117-119.

[4]Steinman RM. Decisions about dendritic cells： past， present， and future[J]. Annu Rev Immunol， 2012， 30：1-22.

[5] 董亮， 賀宏麗， 劉軍， 等. 急性肺損傷早期肺常規樹突狀細胞的動態變化[J]. 中華急診醫學雜志， 2012，21（6）：607-611.

[6]Randolph GJ， Ochando J， Partida-Sanchez S. Migration of dendritic cell subsets and their precursors[J]. Annu Rev Immunol， 2008，26：293-316.

[7]Efron P， Moldawer LL. Sepsis and the dendritic cell[J]. Shock， 2003，20（5）：386-401.

[8]Ding Y， Chung CS， Newton S， et al. Polymicrobial sepsis induces divergent effects on splenic and peritoneal dendritic cell function in mice[J]. Shock， 2004，22（2）：137-144.

[9]Grimaldi D， Louis S， Pene F， et al. Profound and persistent decrease of circulating dendritic cells is associated with ICU-acquired infection in patients with septic shock[J]. Intensive Care Med， 2011，37（9）：1438-1446.

[10]劉軍， 邱海波. 樹突狀細胞介導的免疫功能紊亂在全身性感染中的作用[J]. 中華急診醫學雜志， 2010，19（9）：1004-1006.

[11]張朋書， 劉軍， 邱海波. 脾臟樹突狀細胞在全身性感染中的變化及治療意義[J]. 國際麻醉學與復蘇雜志， 2011，32（2）：244-246.

[12]Matute-Bello G， Frevert CW， Martin TR. Animal models of acute lung injury[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol， 2008，295（3）：L379-399.

[13]Gautier EL， Huby T， Saint-Charles F， et al. Enhanced dendritic cell survival attenuates lipopolysaccharide-induced immuno-suppression and increases resistance to lethal endotoxic shock[J]. J Immunol， 2008，180（10）：6941-6946.

[14]Liu J， Zhang PS， Yu Q， et al. Losartan inhibits conventional dendritic cell maturation and Th1 and Th17 polarization responses： Novel mechanisms of preventive effects on lipopolysaccharide-induced acute lung injury [J]. Int J Mol Med， 2012，29（2）：269-276.

[15]van RLS， Prins JB， Leenen PJ， et al. Allergen-induced accumulation of airway dendritic cells is supported by an increase in CD31hiLy-6Cneg bone marrow precursors in a mouse model of asthma[J]. Blood， 2002，100（10）：3663-3671.

[16]Naik SH， Metcalf D， van NA， et al. Intrasplenic steady-state dendritic cell precursors that are distinct from monocytes[J]. Nat Immunol， 2006，7（6）：663-671.

[17]Hashimoto N， Kawabe T， Imaizumi K， et al. CD40 plays a crucial role in lipopolysaccharide-induced acute lung injury[J]. Am J Respir Cell Mol Biol， 2004，30（6）：808-815.

[18]Naik SH， Sathe P， Park HY， et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo[J]. Nat Immunol， 2007，8（11）：1217-1226.

[19]MacPherson GG， Jenkins CD， Stein MJ， et al. Endotoxin-mediated dendritic cell release from the intestine. Characterization of released dendritic cells and TNF dependence[J]. J Immunol， 1995，154（3）：1317-1322.

[20]De Smedt T， Pajak B， Muraille E， et al. Regulation of dendritic cell numbers and maturation by lipopolysaccharide in vivo[J]. J Exp Med， 1996，184（4）：1413-1424.

[21]Iwasaki A. Mucosal dendritic cells[J]. Annu Rev Immunol， 2007，25：381-418.

（收稿日期：2014-08-04）

（本文編輯：鄭辛甜）

P241-246