EphA7在炎癥狀態下人牙髓組織中的表達和意義

趙俊杰，蘭衛東，董迎春

（南京市口腔醫院，南京大學醫學院附屬口腔醫院，江蘇南京210008）

EphA7在炎癥狀態下人牙髓組織中的表達和意義

趙俊杰，蘭衛東，董迎春

（南京市口腔醫院，南京大學醫學院附屬口腔醫院，江蘇南京210008）

目的：探討EphA7基因在牙髓的炎癥反應和牙源性疼痛中的作用及意義。方法：收集健康牙髓、具有疼痛癥狀的牙髓炎牙髓和無疼痛癥狀的牙髓炎牙髓各18例，分別采用免疫組化染色和Western印跡法檢測EphA7蛋白在不同狀態牙髓組織中的表達水平。結果：免疫組化染色顯示：EphA7在健康牙髓中僅陽性表達于血管內皮細胞和成牙本質細胞；而在炎癥牙髓中，EphA7的表達顯著升高，除陽性表達于上述細胞外，同時還陽性表達于成纖維細胞、炎癥細胞以及神經纖維組織中。Western印跡法檢測結果顯示：與健康牙髓相比，牙髓炎牙髓中EphA7蛋白的表達水平顯著增高（P＜0.05），具有疼痛癥狀的牙髓中EphA7蛋白的表達水平顯著高于無疼痛癥狀的牙髓（P＜0.05）。結論：EphA7基因可能是反映牙髓組織炎癥活動和疼痛狀態的一個標記物。

EphA7；牙髓；牙髓炎；牙源性疼痛

［Chinese Journal of Conservativedentistry，2015，25（4）：197］

牙髓位于堅硬牙本質包繞而形成的狹小髓腔內，其體積的微小改變即可引起髓腔內壓力的升高；同時由于牙髓組織內富含血管和神經，當牙髓發生炎癥時常伴有劇烈、持久的疼痛，且難以通過常規的藥物對其進行有效的治療，因此，關于牙髓炎性疼痛的機制一直是口腔醫學研究的熱點。

Eph基因是擁有25個亞型的受體酪氨酸激酶的大家族，在腫瘤中研究較多，并發現其參與多個系統腫瘤的發生、發展和預后［1-2］。我們在對Eph的多個亞型（EphA1、EphA2、EphA7、EphA10、EphB1、EphB2、EphB4）進行檢測時發現，EphA7在炎性牙髓中的轉錄水平較健康牙髓顯著增高；免疫組化染色顯示，EphA7在正常牙髓中的表達具有更強的特異性和敏感性。因此本實驗選用EphA7基因進行進一步研究。

目前有研究表明，EphA7在不同的神經組織，如腦組織、三叉神經組織以及牙髓神經纖維中均廣泛表達；不僅參與神經系統的發育、炎癥反應和疼痛過程，同時還參與血管內皮細胞的生成和炎癥細胞的發育［3-5］。另有研究發現，EphA7在脊髓損傷引起的脊髓灰質反應性膠質細胞和神經元中表達增高，其反義核苷酸能夠促進肢體早期運動功能的恢復，是一個潛在的控制脊髓損傷急性期疼痛的靶點［6］。然而，關于EphA7基因在牙髓炎和牙源性疼痛中的作用，目前尚未見相關研究報道。本實驗通過檢測EphA7基因在健康和炎癥狀態下的牙髓組織中的表達，以期闡明EphA7基因在牙髓炎癥反應和牙源性疼痛過程中的作用。

1　材料和方法

1.1樣本牙選擇和牙髓組織樣本制備

1.1.1樣本牙選擇

臨床收集54名18～38歲志愿者（知情同意）因智齒或牙髓炎且無保留價值而拔除的第三磨牙和前磨牙54個，其中男30例，女24例；所有患者均無全身性疾病和長期抗生素治療史。根據病史和臨床檢查（X線片和牙髓活力試驗）結果，將其隨機分為3組（n=18）：健康組（取自無齲損、無牙髓炎的第三磨牙）、無疼痛癥狀的牙髓炎組和有疼痛癥狀的牙髓炎組（取自診斷為不可復性牙髓炎的第三磨牙或前磨牙）。

1.1.2牙髓組織樣本制備

牙齒拔除后立即用生理鹽水沖洗干凈，然后用細金剛砂車針在水冷卻下沿牙齒長軸做縱向溝槽；沿溝槽劈開各牙并取出牙髓組織后，分別從每組中各隨機抽取12例牙髓組織，立即保存于液氮中用于Western免疫印跡檢測；各組所余6例牙髓組織分別用40 g/L多聚甲醛固定24 h后，常規制作石蠟切片，分別用于常規組織學和免疫組化染色觀察。

1.2常規組織學觀察

取上述各組石蠟切片，常規HE染色后光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.3免疫組化染色觀察

免疫組化染色采用Envision（Dako公司，美國）兩步法。簡要步驟如下：上述各組石蠟切片常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇（濃度由高到低）至水；高壓蒸汽處理修復抗原；EphA7抗體（1∶100稀釋；Abgent公司，美國）4℃孵育過夜；二抗室溫下孵育30 min；DAB顯色，顯微鏡下掌握顯色程度，蒸餾水終止顯色。每個步驟之間均用PBS洗3 min×2次，以降低非特異性著色。

結果判定根據陽性細胞百分比和染色強度來評估，均以0～3計分。高倍鏡下（200倍）隨機取4個不同的視野，分別對細胞總數及細胞漿染色陽性細胞數進行計數，然后按陽性細胞所占的百分比進行計分：全陰性計為0分；陽性細胞率≤25%計為1分，＞25%且≤50%為2分，＞50%為3分。同時根據染色強度進行計分：陰性計為0分，弱陽性計為1分，中等強度陽性計為2分，強陽性計為3分。每個樣本評分是陽性細胞百分比和染色強度計分之和。

1.4Western免疫印跡檢測

取各組12例牙髓組織，每2例樣本合并一起提取其總蛋白，以BCA法測定蛋白濃度后，100℃變性10 min。在4%～12%預制凝膠中上樣40 μg蛋白樣品，150 V電壓下電泳1 h，然后在200 mA電流下轉膜2 h；50 mL/L脫脂牛奶封閉1.5 h后，加入EphA7一抗（1∶1 000）4°C孵育過夜；加入二抗室溫下孵育2 h，ECL發光。以GAPDH為內參，并用ECL儀器自帶軟件對蛋白印跡圖像進行灰度分析。取樣品EphA7蛋白條帶的灰度值與內參GAPDH條帶灰度值的比值作為該樣品中取EphA7蛋白的相對含量。所有檢測試劑均購于美國Life technologies公司。

1.5統計學分析

2　結果

2.1HE染色觀察結果

HE染色顯示，健康牙髓組織由疏松結締組織如血管、成纖維細胞、神經纖維組織和圍繞在結締組織周邊的成牙本質細胞層組成（圖1a）。牙髓炎樣本中血管擴張充血，血管壁增厚，神經纖維增粗，成牙本質細胞層無序排列；并可見中性粒細胞、淋巴細胞和漿細胞等急慢性炎細胞浸潤（圖1b）。

2.2免疫組化染色觀察結果

免疫組化染色顯示：健康牙髓中，EphA7僅在血管內皮細胞和成牙本質細胞的胞漿中呈陽性表達（圖1c）；在牙髓炎標本中，EphA7的表達較健康牙髓顯著增強，除血管內皮細胞和成牙本質細胞外，EphA7在成纖維細胞、炎癥細胞和神經纖維組織中均呈陽性表達（圖1d）；EphA7基因在伴有疼痛癥狀的牙髓炎標本中的表達較非疼痛性牙髓炎標本顯著增強（圖1e、f）。3組牙髓組織中EphA7的表達水平（評分）以有疼痛癥狀的牙髓炎組最高，健康牙髓組最低；各組間兩兩相比，差異均有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1　3組牙髓組織中EphA7的表達水平（評分）比較（±s）

表1　3組牙髓組織中EphA7的表達水平（評分）比較（±s）

不同字母組間P＜0.05

組別評分健康組 2.17±0.75a無疼痛癥狀牙髓炎組3.83±0.75b有疼痛癥狀牙髓炎組5.00±0.63c

圖1　健康和炎性牙髓組織HE染色及EphA7免疫組化染色觀察

2.3Western免疫印跡檢測結果

半定量分析顯示，EphA7蛋白在3組牙髓組織中的相對表達量以疼痛性牙髓炎組最高，健康牙髓組最低；各組間兩兩相比，差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖2～3）。

圖2　3組牙髓組織中EphA7蛋白相對表達量比較

圖3　Western免疫印跡法檢測EphA7在各組中的表達

3　討論

Eph基因是擁有25個亞型的受體酪氨酸激酶的大家族，近年來在炎癥和疼痛中的關系逐漸受到重視。Ivanov等［7］發現，脂多糖誘導所致全身炎癥的大鼠肺組織中EphA2表達上調，其配體ephrinA1表達下調。隨后Larson等［8］論證了二者在維持大鼠肺組織血管通透性的作用，并發現ephrinA1靜脈注射可引起肺泡壁毛細血管內皮細胞間緊密連接的破壞、白蛋白滲出增加、肺組織水腫。EphA2-ephrinA1信號傳導在早期可調控內皮細胞或上皮屏障的滲透性，晚期則促進了血管內淋巴細胞向炎癥組織的遷移。另有研究發現，EphrinB-EphB受體信號能通過調控神經元的興奮性和脊髓突觸的塑性而參與神經病理性疼痛的發生和維持；椎管內給予EphB受體的拮抗劑-EphB1-Fc和EphB2-Fc嵌合體，可顯著抑制神經損傷誘導的熱痛覺過敏和機械性異常疼痛［9］。

本實驗中發現，EphA7在炎癥狀態下的牙髓組織中的表達水平顯著高于健康牙髓，且分布范圍較廣，除表達于血管內皮細胞和成牙本質細胞外，同時還表達于成纖維細胞、炎癥細胞以及神經纖維組織。該結果初步表明，EphA7可能是一個能反映牙髓炎癥狀態的標記物。另外，在具有疼痛癥狀的牙髓組織中，EphA7基因的表達水平顯著高于無疼痛癥狀的牙髓，表明EphA7可能與牙髓炎性狀態下的牙齒疼痛程度緊密相關。EphA7在炎癥狀態下的牙髓神經組織中高表達還說明，牙髓疼痛機制可能含有神經病理性疼痛的成分。成纖維細胞，又稱牙髓細胞，是牙髓組織中的主要細胞，在牙髓損傷和修復中起重要作用。本實驗中發現炎癥牙髓組織中EphA7在成纖維細胞中的表達較正常牙髓顯著增強，提示EphA7可能參與了牙髓組織的損傷修復。

綜上所述，EphA7在健康牙髓組織中的血管內皮細胞呈陽性表達，而在炎癥牙髓中該表達顯著增強。那么EphA7是否也能在牙髓組織中像EphA2那樣通過與配體ephrinA1結合來調控牙髓血管的滲透性呢？若該猜想得到證實的話，將可能通過改變牙髓組織中EphA7基因的表達來調控牙髓血管通透性、降低水腫，從而降低因髓腔內壓力增高而引起的疼痛；并有可能使EphA7成為治療牙髓的炎癥和緩解疼痛的新靶標。

［1］Day BW，Stringer BW，Boyd AW.Eph receptors as therapeutic targets in glioblastoma［J］.Br J Cancer，2014，111（7）：1255-1261.

［2］Nagano K，Yamashita T，Inoue M，et al.Eph receptor a10 has a potential as a target for a prostate cancer therapy［J］.Biochem Biophys Res Commun，2014，450（1）：545-549.

［3］Luukko K，Loes S，Kvinnsland IH，et al.Expression of ephrin-a ligands and epha receptors in thedeveloping mouse tooth and its supporting tissues［J］.Cell Tissue Res，2005，319（1）：143-152.

［4］Miller K，Kolk SM，Donoghue MJ.Epha7-ephrin-a5 signaling in mouse somatosensory cortex：Developmental restriction of moleculardomains and postnatal maintenance of functional compartments［J］.J Comp Neurol，2006，496（5）：627-642.

［5］Rogers JH，Ciossek T，Ullrich A，et al.Distribution of the receptor epha7 and its ligands indevelopment of the mouse nervous system［J］.Brain Res Mol Brain Res，1999，74（1-2）：225-230.

［6］Figueroa JD，Benton RL，Velazquez I，et al.Inhibition of epha7 up-regulation after spinal cord injury reduces apoptosis and promotes locomotor recovery［J］.J Neurosci Res，2006，84（7）：1438-1451.

［7］Ivanov AI，Romanovsky AA.Putativedual role of ephrin-eph receptor interactions in inflammation［J］.IUBMB Life，2006，58（7）：389-394.

［8］Larson J，Schomberg S，Schroeder W，et al.Endothelial epha receptor stimulation increases lung vascular permeability［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2008，295（3）：431-439.

［9］Song XJ，Zheng JH，Cao JL，et al.Ephrinb-ephb receptor signaling contributes to neuropathic pain by regulating neural excitability and spinal synaptic plasticity in rats［J］.Pain，2008，139（1）：168-180.

Expression and significance of EphA7 in inflamed humandental pulp

ZHAO Jun-jie，LAN Wei-dong，DONG Ying-chun
（Department of Periodontics，Nanjing Stomatological Hospital，Medical School of Nanjing University，Nanjing 210008，China）

AIM：To investigate the role of EphA7 gene in pulp inflammation and odontogenic pain. METHODS：18 healthy controls，18 asymptomatic and 18 symptomatic irreversible pulpitis humandental pulps were included in the study.The protein expression of EphA7 wasdetected by immunohistochemistry and western blotting respectively.RESULTS：In healthy samples，immunohistochemical staining showed that positive EphA7 expression was only in vascular endothelial cells and odontoblasts.In the inflammatory pulps，EphA7 expression increased significantly.In addition to vascular endothelial cells and odontoblasts，EphA7 positive staining was alsodetected in fibroblasts，inflammatory cells and nerve fiber tissues.Western blotting analysis showed that EphA7 expression increased significantly in pulpitis samples compared with healthy controls.In symptomatic irreversible pulpitis samples，EphA7 expression was significantly higher than those in asymptomatic ones.CONCLUSION：EphA7 gene may be a marker reflecting inflammatory and pain state of humandental pulp.

EphA7；dental pulp；pulpitis；odontogenic pain

［文獻標識碼］A ［文章編號］1005-2593（2015）04-0197-04

10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.04.003

2014-10-29；

2015-01-26

國家自然科學基金資助課題（81100768）

江蘇省南京市醫學科技發展專項資金資助課題（YKK11040；QRX11123）

趙俊杰（1983-），男，漢族，南京人。碩士，醫師

董迎春，E-mail：dongyingchun1001@hotmail.com