α-磷酸三鈣/膠原復合體與自體骨骨修復能力比較

李佩祺，吳補領，高 杰，方一如，松本尚之，橋本典也，廖 文，6

（1.南方醫科大學南方醫院牙體牙髓病-國家臨床重點?？?；2.南方醫科大學口腔醫學院，廣東廣州510515；3.大阪齒科大學大學院齒科矯正學講座；4.大阪齒科大學齒科東洋醫學；5.大阪齒科大學齒科理工學；6.四川大學口腔醫學國家重點實驗室，四川成都610041）

α-磷酸三鈣/膠原復合體與自體骨骨修復能力比較

李佩祺1，2，3，吳補領1，高 杰1，方一如4，松本尚之3，橋本典也5，廖 文3，6

（1.南方醫科大學南方醫院牙體牙髓病-國家臨床重點?？?；2.南方醫科大學口腔醫學院，廣東廣州510515；3.大阪齒科大學大學院齒科矯正學講座；4.大阪齒科大學齒科東洋醫學；5.大阪齒科大學齒科理工學；6.四川大學口腔醫學國家重點實驗室，四川成都610041）

目的：探討α-磷酸三鈣/膠原復合體修復大鼠頭蓋骨骨缺損能力。方法：選用8周齡SD大鼠28只，隨機分為自體骨組（n=12）、α-磷酸三鈣/膠原復合材料組（n=12）與空白組（n=4）。自體骨組和材料組于術后4、6、8周3個時間點各處死大鼠4只；空白組大鼠在8周全部處死。分別進行mirco-CT掃描分析，HE、TRAP和ALP染色，比較各組修復骨缺損效果。結果：8周時α-磷酸三鈣/膠原復合物和自體骨的骨體積分數分別為（69.7±3.95）%和（42.475±4.38）%（P＜0.05）；隨著時間延長，α-磷酸三鈣/膠原復合材料逐漸被吸收，同時骨缺損亦逐漸修復；自體骨缺損部在6周后出現大量破骨細胞，大面積移植骨與新生骨被吸收，而α-磷酸三鈣/膠原復合體修復骨缺損中較少發現破骨細胞。結論：α-磷酸三鈣/膠原復合體具有較好骨缺損修復能力，且材料易于吸收。

臨界性骨缺損；α-磷酸三鈣/膠原復合體；自體骨

［Chinese Journal of Conservativedentistry，2015，25（4）：223］

近年牙周組織再生誘導術（guided tissue regeneration，GTR）作為牙周炎患者牙槽骨再生治療的一種有效方法，在臨床中常與骨移植材料并用治療大面積牙槽骨缺損［1］。其中，使用自體骨移植既可提供成骨細胞及促進其前體細胞黏附又不存在外來物質引起的免疫排斥反應，是骨修復治療的黃金手段［2］。然而由于自體骨來源有限、易被吸收以及采集自體骨產生的一系列并發癥等問題，使人們迫切需要開發理想的骨替代物［3］。已經證明，α-磷酸三鈣（alpha-tricalcium phosphate，α-TCP）材料具有良好的骨引導能力，并且已在臨床廣泛應用。然而，臨床使用也發現α-磷酸三鈣材料易殘留在缺損部位，從而引起炎癥反應，影響骨愈合。本實驗前期研究發現，α-磷酸三鈣雖具有良好的骨再生誘導能力，但其骨組織改建時間長，較多材料殘留在新生骨組織中［4］。作為骨組織的重要組成成分，膠原亦是一種理想的人工骨材料［5］，但膠原因機械強度低，降解吸收速度快，骨引導能力較差等問題影響其骨缺損修復效果［6］。有研究發現，膠原中加入人工骨材料可提高材料骨修復能力，并且加快材料降解速度［7］。關于骨誘導材料α-磷酸三鈣與膠原聯合應用的研究報道較少，本實驗擬采用大鼠頭蓋骨臨界性骨缺損模型，在α-磷酸三鈣中加入易于分解吸收的膠原，探討α-磷酸三鈣/膠原復合體的骨缺損修復效果，從而為提高復合材料修復骨缺損的臨床應用研究提供實驗依據。

1　材料和方法

1.1材料準備及合成

首先將5 cm×5 cm大小α-磷酸三鈣（孔隙率80%，空隙直徑200 mm；Taihei Chemical，大阪，日本）粉碎為10～200 μm的多孔α-磷酸三鈣顆粒，再由豬皮中提取膠原并經胃蛋白酶（Nippon Meat Packers，日本）處理；然后將α-磷酸三鈣顆粒與膠原勻漿合成150 mg/mL α-磷酸三鈣/膠原溶液，倒入塑料模具（9 mm×9 mm×1 mm）中，立即在-80℃下冷凍干燥24 h；凍干后的α-磷酸三鈣/膠原復合體類似于海綿狀結構，隨后將其置于140℃真空中使其發生交聯反應。制成的材料成白色海綿狀，于掃描電子顯微鏡下可見膠原成網狀交織于α-磷酸三鈣周圍（圖1）。

圖1　α-磷酸三鈣/膠原復合體

1.2臨界性骨缺損模型的建立

8周SD大鼠（清水動物實驗中心，日本）28只，體質量（250～280）g；動物實驗經大阪齒科大學動物實驗委員會許可批準（動物實驗許可號13-03031）。28只大鼠腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥鈉（Somnopentyl，Kyoritus制藥，日本）麻醉，頭部用聚維酮碘消毒，脫毛備皮，用慢速骨鉆于頭蓋骨中部形成一個9 mm×9 mm×1 mm骨缺損區。然后在28只大鼠中隨機選取24只分為材料組和自體骨組（n=12）用于移植骨材料，剩余4只為空白對照組。材料組：放入α-磷酸三鈣/膠原復合體材料作為實驗組；自體組：將取出的自體骨骨片粉碎，放入缺損區作為對照組；空白對照組：不放入任何材料。所有大鼠中均用可吸收性GTR膜（Japan Gore-Tex Co，日本）覆蓋手術缺損區（圖2）。逐層嚴密縫合肌肉和皮膚。術后給予實驗動物普魯卡因青霉素（15萬單位）肌肉注射（1次/d，共3d）。常規條件下喂養觀察。材料組和自體骨組分別于術后4、6、8周3個時間點各處死大鼠4只，空白對照組于術后8周時處死全部大鼠。

1.3觀察指標

術后第4、6、8周，采用大劑量戊巴比妥鈉（120 mg/kg）處死動物并分離出頭蓋骨，40 mg/L多聚甲醛固定，Micro-CT（SMX-130CT，日本）掃描并拍攝頭蓋骨的三維圖像（電壓67 kV，電流62 μA）。利用RATOC分析軟件（TRI/3D-BON，日本）計算缺損區的骨體積分數（bone volume/total volume，BV/TV）、骨密度（bone mineraldensity，BMD）、骨礦含量分數（bone mineral content/total volume，BMC/TV）來評價骨生成情況；將標本用川本法［8］制成非脫鈣骨切片，并行蘇木精伊紅染色（HE）抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、堿性磷酸酶（ALP）染色，顯微鏡下觀察并拍照。

1.4統計學分析

2　結果

2.1Micro-CT觀察結果

4周時，自體骨組：縱面圖可見骨缺損邊界尚清晰，埋入的自體骨上可見新生骨長成；橫斷面圖可見植入的自體骨散布于缺損部組織中，骨碎片周圍可見低密度軟組織影像。材料組：縱面圖可見材料部分降解，骨缺損邊界清晰；橫斷面可見α-磷酸三鈣/膠原復合體密度低于周圍骨組織，材料中可見少量紅色高密度骨影像，提示此處新骨生成。

6周時，自體骨組：縱面圖可見缺損部骨組織生成，骨缺損面積減少，新生骨密度接近于周圍骨組織，不能清晰分辨骨缺損邊緣及植入自體骨材料；橫斷面圖可見缺損部植入的自體骨相互連接形成骨片，骨缺損低密度影像面積減少。材料組：縱面圖可見骨缺損面積減少，材料中有明顯骨生成影像；橫斷面圖可見材料中高密度新生骨影像進一步增大。

8周時，自體骨組：縱面圖可見骨缺損面積增大，出現明顯的骨吸收現象，中心部有少量骨質殘留；橫斷面可見高密度骨影像減少，低密度軟組織影像面積增大。材料組：縱面圖像未見明顯骨吸收現象，缺損部大部分被新生骨修復?？瞻捉M骨缺損只見邊緣少量骨生成（圖3）。

圖2　臨界性骨缺損建立

圖3　4、6、8周自體骨組及α-磷酸三鈣/膠原復合體材料組Micro-CT結果

2.2 Micro-CT骨計量分析結果

經Micro-CT掃描分析顯示，8周時材料組和自體骨組的BV/TV分別為69.70%和42.47%，兩組相比有統計學差異（P＜0.05）；且兩組間的BMD、BMC/TV值相比均有統計學差異（P＜0.05）。但4、6周時，材料組和自體骨組的BV/TV、BMD、BMC/TV值相比無統計學差異（P＞0.05）（表1）。

表1　自體骨組和α-磷酸三鈣/膠原復合體材料組缺損區骨計量統計分析結果 （±s）

表1　自體骨組和α-磷酸三鈣/膠原復合體材料組缺損區骨計量統計分析結果 （±s）

骨計量 4周（n=4）6周（n=4）8周（n=4）自體骨組材料組t P 自體骨組材料組t P 自體骨組材料組t P BV/TV（%）51.02±5.9648.90±5.940.500.3268.35±3.7762.15±8.751.300.1242.47±4.3869.70±3.94-9.230.00 BMD（mg/cm3）425.47±44.89448.92±65.80.590.29445.10±84.64511.92±142.310.810.23372.02±11.75458.67±80.582.130.04 BMC/TV（mg/cm3）191.25±4.68195.25±40.920.190.43281.05±44.76293.77±123.830.190.43151.30±22.99221.95±49.732.310.03

2.3組織學觀察結果

4周時，HE染色結果顯示自體骨及α-磷酸三鈣/膠原復合體被纖維結締組織包繞，α-磷酸三鈣/膠原復合體中心可見新生骨結節；ALP染色可見自體骨組與材料組均可見骨缺損部材料周邊ALP高表達，顯示植入材料周圍有大量活躍的成骨細胞分泌大量骨基質參與骨缺損修復；植入的α-磷酸三鈣/膠原復合體材料與自體骨部分降解吸收，兩組TRAP染色只見少數的破骨細胞。

6周時，HE染色可見材料組和自體骨組均出現較多新生骨，骨小梁之間形成骨髓腔；ALP染色顯示材料組中ALP表達較自體骨組強，成骨細胞在材料組中更為活躍；同時，TRAP染色顯示此時自體骨組新生骨骨髓腔中出現大量破骨細胞，并形成吸收陷窩，而材料組新生骨中只見少數破骨細胞。

8周時，HE染色顯示自體骨組中，移植自體骨及其周邊新生骨多數被吸收，周圍纖維結締組織長入吸收后的骨陷窩中；材料組中未見α-磷酸三鈣/膠原復合體材料殘留，新生骨與缺損周邊骨界限難以分辨；空白組骨缺損邊緣可見少量骨生成，缺損大部分被纖維結締組織充填。TRAP染色顯示自體骨組可見大量破骨細胞，骨吸收活躍；材料組只見少數破骨細胞，未見明顯骨吸收現象（圖4～6）。

圖4　4、6、8周時自體骨組和材料組HE染色結果（箭頭示局部圖拍攝位置，×10）

圖6　4、6、8周時自體骨組和材料組TRAP染色結果（×10）

3　討論

磷酸三鈣材料因具有良好的骨傳導性、生物相容性、可吸收性、炎癥排斥反應少及其多孔結構利于血管生成而被廣泛應用于臨床骨缺損修復［9］。磷酸三鈣材料主要分為低溫β相（β-TCP）和高溫α相（α-TCP），雖然具有相同的化學組成，但其分子結構不同［10］。β-TCP在燒結溫度上較α-TCP低，易于溶解吸收，但硬度和塑形性較差。α-TCP硬度高，骨修復效果較好［11］，但降解速度慢，易于殘留及難于塑形［12］。為了提高磷酸三鈣材料骨修復效率，我們選用硬度較高的α-TCP與膠原混合形成α-磷酸三鈣/膠原復合體材料，利用膠原較易分解吸收、彈性較好、易于塑形及利于成骨細胞黏附［13］等特點提高α-磷酸三鈣材料的骨修復性能。本實驗組在前期研究中比較不同濃度磷酸三鈣/膠原比材料（20、50、100、200 mg/mL）的骨修復效果時發現，磷酸三鈣含量與材料硬度及骨修復效果成正比，但與材料彈性及塑形性成反比［14］。因此，本實驗選用的α-磷酸三鈣/膠原比為150 mg/mL，具有較高的磷酸三鈣含量，且材料硬度及塑形性較好。當今國內外磷酸三鈣膠原復合體的研究大多集中于β-磷酸三鈣/膠原復合體材料，而對α-磷酸三鈣/膠原復合體的研究較少。我們前期研究發現，α-磷酸三鈣/膠原復合材料能在6周內完全修復非臨界性缺損骨缺損且不殘留于骨組織中［15］。然而，α-磷酸三鈣/膠原復合體能否修復較大的臨界性骨缺損仍是一個未知數。

由于解剖因素，頭蓋骨缺損不易感染，成骨影響因素相對較少，易于分析觀察，因此本實驗選用了大鼠頭蓋骨9 mm×9 mm×1 mm的臨界性骨缺損模型。自體骨為粉碎后的缺損區骨片，骨碎片量較為充足，可完全覆蓋缺損區。同時，α-磷酸三鈣/膠原復合體大小與自體骨相同，在濕潤狀況下與粉碎后的新鮮自體骨重量基本一致。我們使用Micro-CT追蹤觀察骨組織生長情況，并且通過獲取TRAP、ALP非脫鈣組織切片來觀察成、破骨細胞形態以評價缺損區骨代謝狀況，結果顯示，6周時CT可見骨缺損區大量新生骨生成，材料組中可見大量散在高密度骨影像；8周時CT觀察已完全愈合，組織切片可見材料與新生骨間無明顯纖維組織間隙，成骨性能良好。自體骨組在4～6周表現出良好的成骨能力，但在8周時組織中出現大量的破骨細胞引起較大面積骨吸收，極大影響了骨修復效果。提示，α-磷酸三鈣與膠原材料混合使用后能較快實現骨生成及提高材料降解率；在新骨完成了結構和功能重建后，該復合材料可完全被骨組織替代。在組織切片中，8周骨缺損區可見復合材料基本完全吸收，新生骨幾乎完全修復骨缺損，說明α-磷酸三鈣/膠原復合體材料的降解速度與新生骨生成速度相適應。同時該材料具有類似自然骨的多孔結構，這種結構利于細胞和血管的生長及成骨基質的沉積。

本實驗通過大鼠體內α-磷酸三鈣/膠原復合體材料修復臨界骨缺損表明，磷酸鈣鹽材料與膠原復合體材料混合使用后具有適宜于骨生長修復的降解速度，能較快形成新生骨組織，修復較大的骨缺損而成為自體骨替代材料。同時提示在生物材料研究中，不同的材料混合使用可實現優點互補，進一步提高材料性能。然而，本實驗兩種材料混合后的硬度及彈性模量有待進一步檢測，混合后的材料可能進一步降低材料前期負重的能力，從而影響材料的應用。同時，在實際的牙槽骨骨缺損環境中，材料的分解速度是否會進一步加快，是否會對周圍組織產生影響，臨床骨材料修復效果是否依然良好成為我們下一步實驗希望解決的問題。

致謝：感謝大阪齒科大學齒科理工學講座的大力支持和協作

［1］Stoecklin-Wasmer C，Rutjes AWS，Da Costa BR，et al.Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration：A systematic review［J］.Jdent Res，2013，92（9）：773-781.

［2］Fontǎo FN，Diez GF，Bassi AP.Second harvest of mandibular ramus blocks in bone augmentation procedures：A case letter［J］.J Oral Implantol，2014，40（Spec）397-400.

［3］Tessier P，Kawamoto H，Matthewsd，et al.Autogenous bone grafts and bone substitutes-Tools and techniques：I.A 20，000-case experience in maxillofacial and craniofacial surgery［J］. Plast Reconstr Surg，2005，116（5 Suppl）：6S-24S.

［4］Kihara H，Shiota M，Yamashita Y，et al.Biodegradation process of á-TCP particles and new bone formation in a rabbit cranialdefect model［J］.J Biomed Mater Res，2006，79（2）：284-291.

［5］Aravamudhan A，RamosdM，Nip J，et al.Cellulose and collagenderived micro-nano structured scaffolds for bone tissue engineering［J］.J Biomed Nanotechnol，2013，9（4）：719-731.

［6］Harley BA，Leung JH，Silva ECCM，et al.Mechanical characterization of collagen-glycosaminoglycan scaffolds［J］.Acta Biomater，2007，3（4）：463-474.

［7］Xu C，Su P，Chen X，et al.Biocompatibility and osteogenesis of biomimetic Bioglass-Collagen-Phosphatidylserine composite scaffolds for bone tissue engineering［J］.Biomaterials，2011，32（4）：1051-1058.

［8］Kawamoto T，Kawamoto K.Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using kawamot's film method（2012）［J］.Methods Mol Biol，2014，1130：149-164.

［9］Kasai T，Ishikawa K，Suzuki K，et al.Initial evaluation of a ceramic form as a reconstructive material for bonedefects［J］.dent Mater J，2000，19（4）：381-388.

［10］Carrodeguas RG，De Aza S.á-Tricalcium phosphate：Synthesis，properties and biomedical applications［J］.Acta Biomater，2011，7（10）：3536-3546.

［11］Yamada M，Shiota M，Yamashita Y，et al.Histological and histomorphometrical comparative study of thedegradation and osteoconductive characteristics of α-and β-tricalcium phosphate in block grafts［J］.J Biomed Mater，2007，82（1）：139-148.

［12］Grandi G，Claiton Heitz，Luiz Alberrtodos Santos，et al.Comparative histomorphometric analysis between α-Tcp cement and β-Tcp/Ha granules in the bone repair of rat calvaria［J］.Mater Res，2011，14（1）：11-16.

［13］Brodie JC，Merry J，Grant MH.The mechanical properties of calcium phospate ceramics modified by collagen coating and populated by osteoblasts［J］.J Mater Sci Mater Med，2006，17（1）：43-48.

［14］Matsuno T，Nakamura T，Kuremoto KI，et al.Development of beta-tricalcium phosphate/collagen sponge composite for bone regeneration［J］.Dent Mater J，2006，25（1）：138-144.

［15］Arima Y，Uemura N，Hashimoto Y，et al.Evaluation of bone regeneration by porous alpha-tricalcium phosphate/atelocollagen sponge composite in rat calvarialdefects［J］.Orthod Waves，2013，72（1）：23-29.

Alpha-tricalcium phosphate/atelocollagen sponge composite versus autogenous bone for bone repair efficacy

LI Pei-qi*，WU Bu-ling，GAO Jie，FANG Yi-ru，MATSUMOTO Naoyuki，HASHIMOTO Yoshiya，LIAO Wen
（*Department of Stomatology，Nanfang Hospital，Southern Medical University；College of Stomatology，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China；Department of Orthodontics，Osakadental University，Japan）

AIM：To study the effects of α-tricalcium phosphate（α-TCP）/atelocollagen sponge composite in the repair of calvarialdefects in rats.METHODS：Bonedefects（diameter，8 mm；depth，1.0 mm）were created in 28 male SD rats aged 8 weeks.The rats weredivided into 3 groups.In α-TCP group（n=12）the bonedefects were filled with α-TCP/atelocollagen sponge composite，in positive control group（n=12）with autogenous bone，in blank control group（n=4）with nothing.The rats in α-TCP and positive control groups were euthanized at 4，6，and 8 weeks after surgery respectively（n=4）.The rats in blank control group（n=4）were euthanized 8 weeks after surgery.The calvarial bone was scanned by micro-CT.HE TRAP and ALP staining were performed for the evaluation of new bone formation.RESULTS：Micro-CT images at 8 weeks after surgery revealed that，in α-TCP and positive control groups the bone volume was as（69.7±3.95）%and（42.475±4.38）%respectively（P＜0.05）.Histological analysis revealed that in α-TCP group new bone contiguous with original bone was observed and the composite was absorbed.In positive control group lot of osteoclasts and absorption of the transplanted autogenous bone were observed.In blank control group little new bone was observed at the boundary of thedeffects.CONCLUSION：α-TCP/atelocollagen sponge composite is effective in the repair of bonedefect.

criticaldefect；α-tricalcium phosphate/atelocollagen sponge composite；autogenous bone

［文獻標識碼］A ［文章編號］1005-2593（2015）04-0223-06

10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.04.008

2014-09-30；

2015-02-05

國家自然科學基金項目（81371137）

李佩祺（1987-），男，漢族，廣東深圳人。碩士生（導師：吳補領）

吳補領，E-mail：bulingwu@smu.edu.cn