機械壓應力刺激對人牙髓干細胞體外增殖礦化的影響

肖 敏，陳 博，李明偉，何文喜，余 擎

（第四軍醫大學口腔醫院牙體牙髓病科軍事口腔醫學國家重點實驗室，陜西西安710032）

·基礎研究·

機械壓應力刺激對人牙髓干細胞體外增殖礦化的影響

肖 敏，陳 博，李明偉，何文喜，余 擎

（第四軍醫大學口腔醫院牙體牙髓病科軍事口腔醫學國家重點實驗室，陜西西安710032）

目的：研究不同大小的周期性機械壓應力刺激對人牙髓干細胞（hDPSCs）體外增殖和礦化的影響。方法：用體外離心力加壓模式，對各組hDPSCs施加30 min/d、大小分別為170、210、250 g的周期性機械壓應力刺激，以不加力組作為對照。分別利用CCK-8試劑盒及堿性磷酸酶（ALP）試劑盒檢測各組hDPSCs的增殖情況及ALP活性；茜素紅染色檢測各組hDPSCs的礦化能力；透射電鏡觀察各組hDPSCs的超微結構。結果：3種大小的機械壓應力刺激均可顯著抑制hDPSCs增殖、ALP活性顯著下降（P＜0.05）；各加力組形成的礦化結節明顯減少，且以250 g的應力刺激對礦化能力的抑制最為顯著（P＜0.05）。結論：一定大小、頻率范圍內的周期性機械壓應力刺激可抑制人牙髓干細胞體外增殖和礦化，且對礦化的抑制作用與周期性機械壓應力大小成正相關。

牙髓干細胞；周期性機械壓應力；增殖；礦化

［Chinese Journal of Conservativedentistry，2015，25（4）：187］

緊咬、磨牙癥等牙齒咀嚼功能的異常會導致牙齒過度磨耗，引起牙髓炎，繼而導致牙髓內壓力升高［1-2］。同時，當牙齒受到理化和生物刺激時，髓腔內壓力必然會發生變化，從而對牙髓組織內細胞的動態平衡產生影響。牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）是一類具有高度增殖、自我更新、多向分化潛能的間充質干細胞［3-4］。以往研究表明，不同類型的機械力刺激能夠誘導干細胞向特定類型的組織分化，提示機械應力刺激可能對間充質干細胞的某些生物學特性具有調控作用［5］。雖然DPSCs能夠通過分化為成牙本質細胞以形成繼發性或修復性牙本質等組織，維持髓腔內環境的平衡從而保護牙髓［6-8］，但是DPSCs各項生物學性狀對機械應力刺激的反饋尚未得到充分研究。本研究基于體外離心力加壓模式，通過比較不同大小的周期性機械應力刺激對DPSCs增殖和礦化能力的影響，以期找到機械應力刺激應用于DPSCs的適宜方式，為今后的基礎研究和臨床應用提供參考依據。

1　材料和方法

1.1主要試劑和儀器

改良型α-MEM培養基、胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）（Hyclone，美國）；Ⅰ型膠原酶、Dispase酶（Gibico，美國）；β-甘油磷酸鈉、維生素C、地塞米松、Alizarin Red S、Oil Red O（Sigma，美國）；鼠抗人STRO-1-PAC、CD29-PE、CD34-DE CD90-PE、CD105-PE、CD146-PE（Biolegend，美國）；細胞培養板（Costar，美國）；CCK-8試劑盒（DOJINDO，日本）；堿性磷酸酶試劑盒（南京建成生物工程研究所）；BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒（碧云天生物技術）；TDZ5-WS臺式低速離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）；二氧化碳恒溫孵箱（Thermo，美國）；酶標儀（Power Wave 340，Bio-TEK，美國）；倒置相差顯微鏡及照相系統（Olympus，日本）；流式細胞儀（BD，美國）；JEM-100SX透射電子顯微鏡（JEOL，日本）。

1.2hDPSCs的分離、培養、純化和鑒定

收集15～20歲志愿者（知情同意）因正畸需要而完整拔除的新鮮健康第三磨牙，經含雙抗PBS反復沖洗后，無菌條件下劈開牙齒，取出牙髓，剪去根尖1/3，剩余牙髓組織剪碎后加入3 mg/mL的Ⅰ型膠原酶和4 mg/mLdispase，置37℃孵箱內消化50 min后離心去上清；隨后經含血清培養基反復漂洗2次并離心后，沉淀以含200 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的α-MEM培養基重懸并過細胞篩，單細胞懸液接種于6孔板內，置于37℃、50 mL/L CO2孵箱中繼續培養，每3d換液；待細胞生長至80%匯合后，胰蛋白酶（2 g/L胰蛋白酶加0.2 g/L EDTA）消化收集細胞，按1∶3傳代；取對數生長期的P1代細胞經有限稀釋法獲得單細胞克隆，待克隆長至96孔板孔底80%后，取多個克隆培養的細胞胰酶消化混合后擴大培養以用于后續試驗。收集P3代相同個體來源的hDPSCs，經流式細胞儀檢測STRO-1、CD29、CD34、CD45、CD90、CD105、CD146等特定抗原的表達；經成脂誘導液（含100 mL/L FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、0.1 μmol/L地塞米松、0.2 mmol/L吲哚美辛、0.01 mg/mL胰島素、0.5 mmol/L IBMX的α-MEM培養基）和礦化誘導液（含100 mL/L FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、10 nmol/L地塞米松、50 mg/L維生素C、10 nmol/L β-甘油磷酸鈉的α-MEM培養基）分別培養3、4周后，行油紅O及茜素紅染色，鑒定細胞多向分化能力。

1.3機械壓應力的加載

本實驗參考并改進以往文獻方法［9-10］，經由配備酶標板轉子的臺式低速離心機產生的離心力對細胞施加相應大小的壓應力。離心力大小是由離心機離心半徑（R，cm）及旋轉速度（RS，r/min）決定?；诠剑‵=1.18×10-5×R×RS2）計算得出離心力大?。? 000 r/min=170g；1100r/min=210g；1 200 r/min=250 g）。本實驗中細胞按施加應力刺激的大小分為3組（170、210、250 g），每天刺激30 min后置回孵箱繼續培養，對照組常規培養期間亦每日置于超凈臺30 min，各實驗獨立重復3次。

1.4細胞增殖活力的檢測

取P4代hDPSCs接種于96孔板（2.5×103/孔），各組每個時間點設6個復孔，待細胞完全貼壁后更換為無血清培養基饑餓24 h，然后以含100 mL/L FBS的培養基持續培養7d，每3d換液，期間按照實驗分組進行加力，分別在應力刺激后的第1～7天，每日固定時間取樣，每孔加入10 μL CCK-8溶液，置孵箱繼續培養3～4 h后，酶標儀測定每孔450 nm吸光度值。

1.5ALP活性及染色的檢測

取P4代hDPSCs接種于24孔板（2×104/孔），各組每個時間點4個復孔，礦化誘導液培養14d，期間按照實驗分組進行加力。分別于加力后第3、7、9、11、14天固定時間點取樣，每孔加200 μL 3 g/L Triton X-100，4℃過夜裂解細胞，隨后每孔吸取30 μL樣本移入96孔板對應孔，依照試劑盒說明加入各組份，酶標儀測定520 nm吸光度值。同期取加力后第7天各組樣本以BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒進行ALP染色觀察。

1.6 茜素紅染色及鈣含量的測定

取P5代hDPSCs接種于12孔板（4×104/孔），每組5個復孔，礦化誘導液培養并進行加力，持續培養14d后進行茜素紅染色及定量試驗：700 mL/L乙醇固定30 min，PBS漂洗3次，每孔加入500 μL茜素紅（pH=4.2），室溫避光靜置15 min，去離子水洗5次，光鏡下觀察礦化結節形成情況；然后每孔加入500 μL 100 mL/L氯化十六烷基吡啶（cetylpyridinium chloride）孵育15 min，每孔吸取100 μL樣本加入96孔板，酶標儀測定562 nm吸光度值以進行樣本鈣含量測定。

1.7細胞超微結構的觀察

取P4代hDPSCs接種于6孔板（5×104/孔），給予細胞每天30 min 250 g的機械壓應力刺激。以未加力hDPSCs為對照，持續7d后收集兩組細胞各1×106，細胞團用25 mL/L戊二醛溶液4℃固定過夜，透射電子顯微鏡（TEM）觀察細胞超微結構。

1.8統計學分析

2　結果

2.1hDPSCs原代培養、分離純化和鑒定

酶消化法分離獲得的原代hDPSCs在72 h后呈克隆樣生長，大多數為成纖維樣細胞，呈梭形或多角形（圖1a）；經單克隆篩選后，細胞大小、形態均一，成梭形（圖1b）。流式細胞儀檢測結果顯示，所獲細胞符合hDPSCs表型特征（圖2）。礦化誘導培養3周后，茜素紅染色陽性，鏡下可見礦化結節（圖3a）。成脂誘導培養4周后，倒置相差顯微鏡下可見油紅脂滴染色陽性，脂滴呈紅色（圖3b）。

圖2　流式細胞儀分析hDPSCs的表面抗原特征表型（P2、P3表示抗原陽性區域）

2.2周期性壓應力對hDPSCs增殖的影響

圖3　hDPSCs多向分化能力（×100）

CCK-8檢測結果顯示，與對照組相比，加力組hDPSCs增殖活力顯著降低，以加力第4、5、6、7天有統計學差異（P＜0.05）（圖4）。各加力組間增殖活力無顯著差異（P＞0.05）。

圖4　周期性壓應力對hDPSCs增殖的影響

2.3周期性壓應力對細胞ALP活性的影響

加力刺激7d后ALP染色結果顯示，對照組ALP活性顯著高于各加力組（圖5）。ALP活性定量結果顯示，與對照組相比，加力組各時間點ALP活性均顯著降低（P＜0.05）（圖6），與170 g和210 g組相比，250 g組對ALP活性的抑制作用最強（P＜0.05）。

圖5　周期性壓應力第7天ALP染色結果（×100）

圖6　周期性壓應力各組hDPSCs的ALP活性定量結果

2.4hDPSCs茜素紅染色及鈣含量檢測

茜素紅染色結果顯示，與對照組相比，各加力組形成的礦化結節數目顯著減少（P＜0.05）（圖7a）；鈣含量測定顯示，與對照組相比，各加力組的鈣含量也顯著降低（P＜0.05）（圖7b），且250 g加力組降低程度最明顯，170 g組與210 g組間無明顯差異（P＞0.05）。

圖7　周期性壓應力對hDPSCs礦化結節形成的影響（*與對照組相比P＜0.05；#與250 g組相比P＜0.05）

2.5hDPSCs超微結構的改變

透射電鏡結果顯示，對照組細胞形態呈圓形或不規則形，表面有大量微絨毛，核仁大而明顯，核質比（N/P）大，細胞器少，可見線粒體和內質網（圖8a）；而經250 g壓應力作用7d后，可見核內異染色質明顯增多呈斑塊狀，核質比減?。▓D8b），胞漿內溶酶體增多（圖8c）。

圖8　周期性壓應力對hDPSCs超微結構的影響（N：細胞核；P：細胞質；RER：粗面內質網；H：異染色質；L：溶酶體）

3　討論

力學微環境作為能夠影響細胞結構和功能的外界因素，已經受到越來越多的關注。諸多研究表明，細胞在應力作用下會發生形態、結構和功能的改變［11-12］。以口腔頜面部為例，咀嚼運動、正畸矯治力甚至組織炎癥水腫狀態下的張力，都有可能對該處各類組織來源的干細胞產生一定影響，因此，作為牙體牙髓領域重要的研究對象，牙髓干細胞的增殖、分化、遷移等活動必然受到各種類型機械力產生的影響。牙髓組織再生一直是牙體牙髓領域重要的研究課題，但目前研究多集中于炎癥微環境下牙髓牙本質復合體的再生，而對于力學微環境下牙髓組織再生的研究少有報道。

相關研究認為，167 g的離心力所產生的力學效應最接近臨床正畸矯治力，即相當于33.5 g/cm2的持續壓應力［10］。并且，相較于持續性的加力，間歇性或周期性加力能更顯著引發細胞的反饋效應，故本實驗選擇200 g上下的離心力，對hDPSCs施加不同大小的周期性力學刺激；結果顯示，當給hDPSCs施加170、210、250 g的周期性壓力刺激后，相較于對照組，其細胞增殖活力均受到顯著抑制，證明周期性壓力刺激誘發了hDPSCs對力學刺激的反饋，進而降低了hDPSCs的增殖活力。有研究認為周期性壓應力對干細胞增殖的作用尚存爭議：細胞對周期性壓力的反應取決于壓力的大小和細胞的類型，低水平的機械刺激促進增殖，高生理水平的應力將抑制細胞增殖［11-12］。Kokkinos等認為機械應力會影響細胞有絲分裂的潛能［13］。本研究通過對人牙髓干細胞ALP活性及礦化結節形成能力的比較觀察，發現應力刺激后，hDPSCs的礦化能力受到抑制，而且250 g加力組抑制作用最為顯著，說明應力刺激后，細胞礦物質沉積能力發生了改變。結果表明，在一定大小范圍內的壓應力刺激下，hDPSCs礦化能力的受抑制效應可能與力值大小成正相關?；谝陨涎芯拷Y果，我們通過透射電鏡觀察到未經壓應力刺激的hDPSCs具有干細胞典型的超微結構特點：細胞體積小、核仁大而明顯、核質比例大、細胞質內細胞器少等。而經250 g周期性壓應力作用7d后，hDPSCs有早中期凋亡表現：細胞核異染色聚集、細胞質內溶酶體增多，表明250 g的壓應力對細胞活力產生了影響。

應力刺激對DPSCs增殖、分化影響的報道不盡相同［14-15］，可能與機械應力加載方式、持續時間及細胞類型的差異相關。因不同來源的細胞對相同應力刺激的反饋具有特異性，同一細胞對不同大小的應力響應也不同［16］，本研究主要參考相同應力加載方式下對其他來源細胞進行的體外研究；本研究選擇的壓力值可能高于生理水平，對hDPSCs的增殖和礦化產生了抑制作用。后續研究將進行對hDPSCs較低水平的力學刺激，以期找到最適宜的力值大小和應力加載方式。

以往研究中的體外階段均是基于二維平面培養細胞的模式進行力學刺激［17］。但體外二維培養與體內環境中的細胞對力學刺激的反應差別明顯［18］，其結果不能反映體內三維狀態生長時細胞的真實情況。近年來，隨著組織工程技術及材料科學的發展，基于細胞/支架材料復合體的三維培養模式成為應用熱點。本研究下一步將基于三維培養模式施加力學刺激，并進行體內觀察。

綜上所述，本研究基于體外離心力加壓模式，通過對受力學刺激后hDPSCs增殖、礦化能力等生物學性狀的比較研究，證明了一定范圍內的機械應力可誘發hDPSCs產生應答反應，在周期性機械應力作用下會發生形態結構和功能的改變，為后續研究提供了理論基礎。

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Influence of mechanical stress on the proliferation and mineralization of humandental pulp stem cells in vitro

XIAO Min，CHEN Bo，LI Ming-wei，HE Wen-xi，YU Qing
（State Key Laboratory of Military Stomatology，Department ofdperativedentistry and Endodontics，School of Stomatology，The Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，China）

AIM：To explore the effects of mechanical stress on the proliferation anddifferentiation of humandental pulp stem cells（hDPSCs）.METHODS：HumandPSCs were cultured and subjected to cyclic mechanical stress at 170 g，210 g and 250 g respectively for 30 min everyday.UntreateddPSCs served as controls.After that，cell proliferation and ALP activity was examined by CCK-8 and ALP kit respectively.The formation of mineralized nodules wasdetermined using half-quantitative Alizarin Red S assay.Cell ultrastructure was observed by the transmission electron microscope.RESULTS：CCK-8 resultsdemonstrated that cell proliferation was reduced（P＜0.05），ALP activity and mineralization capacity of stress-treateddPSCs weredescended by the stress treatment.The 250 g group had the most significant inhibition（P＜0.05）.CONCLUSION：Cyclic mechanical stress can inhibit the proliferation and mineralization of hDPSCs in vitro in a stress valuedependent manner.

humandental pulp stem cells；cyclic mechanical stress；proliferation；mineralization

［文獻標識碼］A ［文章編號］1005-2593（2015）04-0187-06

10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.04.001

2014-12-02

國家自然科學基金資助項目（31271048）

肖敏（1988-），女，漢族，江西贛州人。碩士生（導師：余擎）

余擎，E-mail：yuqing@fmmu.edu.cn