內蒙古西部地區本土葡萄酒釀酒酵母發酵特性研究

王鳳梅馬利兵

（1.　包頭輕工職業技術學院，包頭　014030；2. 內蒙古科技大學　數理與生物工程學院，包頭014010）

內蒙古西部地區本土葡萄酒釀酒酵母發酵特性研究

王鳳梅1馬利兵2

（1.包頭輕工職業技術學院，包頭014030；2. 內蒙古科技大學數理與生物工程學院，包頭014010）

對內蒙古西部地區分離得到的6株釀酒酵母進行了發酵特性的比較。首先對酵母進行了耐酒精、耐SO2、耐低溫、耐低pH、耐高糖和耐高鹽的測試，隨后進一步通過葡萄汁的發酵實驗，分析比較了菌株的發酵力、酒精度、殘糖量、總酸和揮發酸含量等理化指標，最終篩選出兩株發酵性能優良的菌株，有望應用于內蒙古西部地區特色葡萄酒的生產。

葡萄酒；釀酒酵母；發酵特性

酵母菌普遍存在于葡萄園葡萄葉片、果實、根際以及土壤團粒中，尤其是葉片和果實表面是各種酵母的天然棲息地。在傳統的葡萄和葡萄酒產區，酵母菌已逐漸適應了當地的氣候條件、土壤條件和葡萄品種，再加上自然選擇的作用而形成適應于不同類型葡萄酒的菌系［1-3］。釀酒酵母菌的發酵特性因菌株的不同而存在明顯差異，菌株的不同導致利用的底物不同、生成的化學物質不同，從而使葡萄酒的呈味物質存在差異，賦予產品獨特的風味［4，5］。從釀造學的觀點來看，用本土菌種接種發酵或者與其他菌種相混合進行發酵，可以生產出具有地區特色的葡萄酒［6］。當地優選的菌種由于適宜當地的風土環境，因而具有更強的發酵競爭力。

內蒙古西部地區，屬中溫帶半干旱大陸性氣候，日照充足，干旱少雨，晝夜溫差大，有效積溫高，是我國的優質釀酒葡萄產區。從當地的釀酒葡萄基地中分離具有優良特性的葡萄酒酵母，對釀造具有地域特色和獨特風格的產地葡萄酒具有重要的價值。

本研究對分離自內蒙古西部幾個葡萄酒產區的6株酵母菌進行耐受性實驗和發酵實驗，篩選適于工業生產應用的優良酵母菌株，有望供地方特色葡萄酒生產利用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗用培養基 YPD培養基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）［7］：酵母浸粉1%（W/V），蛋白胨2%（W/V），葡萄糖2%（W/V）。

1.1.2 實驗菌株 供試菌株為內蒙古西部釀酒葡萄產區通過分離鑒定得到6株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和1株商業酵母D254。

1.1.3 菌種活化和擴大培養 將保藏的釀酒酵母菌株分別接種于YPD液體培養基中，于28℃下培養48 h。隨后，將活化后的菌種按5%的接種量接種于已裝有100 mL YPD液體培養基的三角瓶中，于28℃、轉速72 r/min搖床中培養。

1.1.4 葡萄汁 將新鮮、成熟的赤霞珠葡萄經破碎壓榨，過濾取汁，葡萄汁含糖量228.1 g/L，總酸8.5 g/L，pH值3.3，添加總SO2約60 mg /L。

1.2 方法

1.2.1 釀酒酵母耐受性分析 將滅菌的YEPD液體培養基10 mL加入帶有杜氏發酵管的試管中，分別在采用不同溫度（9℃、12℃、15℃、18℃）、不同pH值（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0），不同濃度的乙醇（10%vol、12%vol、16%vol、18%vol）、SO2（100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L）、糖（30%、40%、50%、60%）、鹽（8%、10%、12%、14%、16%）條件下，按酵母終濃度106個/mL的量接種，做3個平行重復，25℃下培養3 d，觀察酵母菌的生長情況［8］。

1.2.2 發酵試驗 以赤霞珠為原料釀造葡萄酒，將原料破碎取汁。然后將活化的菌株以終濃度106個/mL的量接種于1 L的葡萄汁中，28℃靜置發酵。設置3個平行重復，每隔24 h，搖動瓶子，以驅除CO2，稱重。當失重量為24 h之前總重量的0.2%時，視為發酵終止。根據CO2失重量繪制發酵曲線，并測定各菌株發酵液的酒精度、總酸、揮發酸、殘糖等指標。

1.2.3 檢測方法 參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》［9］，酒精度（20℃條件下）采用酒精計法、殘糖量采用費林試劑直接滴定法、總酸（以酒石酸計）采用指示劑法、揮發酸（以乙酸計）采用蒸餾法測定。

1.2.4 統計方法 各生化指標數據采用SPASS 19.0統計軟件進行分析。差異顯著性設為P＜0.05。

2 結果

2.1 釀酒酵母耐受性試驗

2.1.1 酵母對低溫耐受性測試結果 菌株對低溫耐受性測試結果見表 1。由表 1可知，所有供試菌株均不能耐受 9℃以下的低溫，12℃時生長明顯受到抑制，各菌株對低溫的耐受性無明顯差異。

表1 菌株對低溫耐受性測試結果

2.1.2 酵母對低pH耐受性測試結果 由表 2可知，在pH為3.0-4.0時，所有供試菌株均能旺盛生長；而在pH為2.5時，則生長受到抑制，大部分菌株均能耐受pH2.0的酸度。菌株M59最低只能耐受pH2.5的環境，pH2.0時不能生長，耐受能力最弱。

表2 菌株對低pH耐受性測試結果

2.1.3 菌株對酒精耐受性測試結果 菌株對酒精耐受性測試結果見表 3。隨著酒精含量的增高，酵母菌的生長逐漸減弱。菌株在酒精含量為10%和14%時，均能正常生長。菌株M33和菌株M59不能耐受16%的酒精。菌株E42和E51的耐酒精能力最強。

表3 菌株對酒精耐受性測試結果

2.1.4 菌株對SO2耐受性測試結果 在生產葡萄酒過程中，葡萄原料較好的情況下，SO2使用量在30-100 mg/L；在葡萄原料相對較差的情況下，使用量不超過80-150 mg/L［10］。葡萄酒釀造中酵母菌株要求有較高的耐SO2能力。菌株對SO2耐受性測試結果見表 4，除M40外，所有供試菌株均能耐受200 mg/L的SO2。菌株M33、E51和D254的耐SO2能力最強。

表4 菌株對SO2耐受性測試結果

2.1.5 酵母對高糖耐受性測試結果 由表 5可知，所有供試菌株均可耐受50%的糖，糖濃度達到60%時不能生長，各菌株對高糖的耐受性無明顯差異。

表5 菌株對高糖耐受性測試結果

2.1.6 酵母對高鹽耐受性測試結果 由表 6可知，NaCl濃度在8%-10%時，所有供試菌株生長狀態良好；當濃度達到14%時，大部分的供試菌株不能生長，菌株M40能耐受14%的NaCl，耐受能力最強。

表6 菌株對高鹽耐受性測試結果

2.2 發酵試驗

2.2.1 發酵速率 不同酵母發酵速率變化曲線見圖1。從圖 1中可以看出，菌株E67、M40起酵遲緩，其余菌株起酵較快且起酵時間相差不大；發酵進行到48 h時，所有菌株的CO2失重量達到高峰，此時發酵速率最高，其后速率逐漸降低。

圖1 不同酵母發酵速率變化曲線

2.2.2 其他釀酒特性指標的測定 不同酵母發酵的葡萄酒的理化指標見表 7。據表 7可知，所有菌株發酵的葡萄酒的酒精度、殘糖和揮發酸等指標均符合國家標準［11］，即葡萄酒的酒精度≥7%（vol），干葡萄酒殘糖含量≤4 g/L，揮發酸含量≤1.2 g/L。商業菌株D254與菌株E42和E51總CO2失重量、酒精度差異不顯著，但與其他菌株差異顯著。由此可知，6株本土酵母菌中E42和E51的總CO2失重量最高、產酒精能力比較強，雖然E51酒樣揮發酸比商業菌株D254高，但揮發酸含量均符合國家標準理化指標要求。

表7 不同酵母發酵的葡萄酒的理化指標

3 討論

釀酒酵母在發酵過程中會受到各種脅迫條件的影響，當脅迫條件超過細胞的生理功能極限時便會對細胞的生存能力和發酵過程產生負面的影響［12］。為了避免發酵過程受到阻遏或發生遲滯現象，要求酵母必須具備足夠的脅迫應答能力以抵御不良條件所造成的影響［13］。掌握菌株對脅迫條件的耐受性是進行工業生產的基礎，為有針對性地選育菌株提供了依據。

在葡萄酒的釀造中，具有較高酒精耐性的酵母菌株是保證較高的酒精產率和發酵順利進行的前提條件。酒精濃度過高會對酵母產生毒性，抑制細胞的生長及發酵活性。所以，酵母的發酵能力很大程度上取決于它們自身耐酒精能力的大?。?4，15］。酒精耐受性不強可能會導致發酵緩慢或終止，糖不能被完全發酵，殘糖量較高。酒精耐受性是各種脅迫條件中國內外研究最多的，張穗生等［16］研究了釀酒酵母酒精耐受性機理，邢建宇等［17］采用Plackett-Burman設計方法研究了培養基的成分對釀酒酵母生長以及乙醇耐受能力的影響。吳華昌等［18］從白酒窖池的酒糟中篩選出一株能耐18%乙醇的酵母菌株。本試驗中，商業酵母D254不能耐受18%的酒精，但菌株E42和E51在酒精含量為18%仍能生長，優于商業酵母D254，酒精耐受力最強。

高滲透脅迫主要發生在發酵初期，糖是酒精發酵的基質，高濃度的葡萄糖產生的滲透壓會抑制酵母菌的生長，因此要求釀酒酵母菌株應具有較高的高滲透耐受性。含糖量在12%-18%的葡萄汁起酵迅速，隨著糖濃度的升高，發酵逐漸受到抑制［19，20］。楊魯君等［21］從黃酒廠的麥曲、酒藥、發酵醪中分離到具有耐高滲透壓的釀酒酵母菌株。本試驗中的所有菌株均能耐受50%以下的葡萄糖濃度，不能耐受60%葡萄糖濃度。NaCl濃度較高時，使發酵醪具有較高滲透壓，同樣會引起酵母的一些變化，抑制酵母的生長繁殖和發酵性能［22］，試驗中的菌株除M40外，所有菌株均不能耐受14%的NaCl。

在本研究的酵母耐受性試驗中，商業菌株D254與供試菌株差異不顯著，并沒有體現它的優越性。在釀酒酵母的篩選和評價試驗中，小容器發酵是非常關鍵的試驗手段，它必須在相同的發酵條件下，體現不同酵母對葡萄酒的分析和感官質量的影響［23］。發酵試驗中各菌株發酵后的葡萄酒的理化指標均符合國家標準，菌株E42和E51具有良好的乙醇轉化能力。短時間的試驗無法對菌株做出全面的評價，其在中試和大生產中的發酵性能仍需多年大量的觀察和試驗。

4 結論

本研究分離的釀酒酵母各菌株對低溫和高糖的耐受性無明顯差異；菌株E59最低只能耐受pH2.5的環境，pH2.0時不能生長，耐受低pH值能力最弱；菌株E42和E51能耐受18%的酒精，耐酒精能力最強；E51和M33能耐受250 mg/L的SO2，耐SO2能力最強；菌株M40能耐受14%的NaCl，耐受鹽能力最強。發酵實驗中，菌株E67、M40的發酵遲緩，其余菌株無差異；菌株E42和E51產酒精能力最強。綜合比較，菌株E42和E51由于耐性優良，產酒精能力強，是具有潛在應用價值的菌株。

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（責任編輯 李楠）

Fermentative Characteristics of Indigenous W ine Saccharomyces cerevisiae Isolated from W estern Area of Inner M ongolia

Wang Fengmei1Ma Libing2
（1. Baotou Light Industry Vocational Technical College；Baotou014030；2. School of Mathematics，Physics and Biological Engineering，Inner Mongolia University of Science & Technology，Baotou014010）

This study compared the fermentative characteristics of 6 strains of Saccharomyces cerevisiae isolated from western area of Inner Mongolia. Firstly， the resistances of these strains on alcohol， SO2， low temperature， low pH， glucose and salt were tested；then fermentative experiment was performed by seeding these strains respectively into grape juice， the following physical and chemical indexes were measured and compared：the fermenting power of these strains， the alcoholic strength， the residual sugar， the content of total acid and volatile acid in fermentation liquor. On the basis of above experimental results， 2 strains of S. cerevisiae with excellent fermentative characteristics were screened，and they are expected to be utilized in producing indigenous wine in the western area of Inner Mongolia.

wine；Saccharomyces cerevisiae；fermentative characteristics

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.029

2015-01-14

國家自然科學基金項目（31160245）

王鳳梅，女，碩士，副教授，研究方向：發酵工藝研究；E-mail：maywfm@126.com

馬利兵，男，博士，教授，研究方向：細胞工程及基因工程；E-mail：413683527@qq.com