g 谷氨酰環化轉移酶對斑馬魚早期發育的影響

段小海 宋焱龍 胡 煒

(1. 中國科學院水生生物研究所淡水生態與生物技術國家重點實驗室, 武漢430072; 2. 中國科學院大學, 北京100049)

谷胱甘肽(GSH)是細胞內最重要的抗氧化和抵抗自由基的物質, 與許多生理生化反應密切相關,比如細胞信號的轉導, 外源物的代謝和硫醇二硫化轉換作用等。谷胱甘肽不僅保護細胞膜免受超氧化合物的攻擊, 同時維持含硫醇基團蛋白質的還原性,以維持它們正確的生物學功能, 當細胞不能保持谷胱甘肽正常含量時其生物學功能會遭受不可逆的破壞[1]。細胞還原性的維持對于細胞凋亡、細胞分化、細胞凋亡、基因表達以及表觀遺傳修飾都具有重要意義。胚胎發育過程中涉及一系列高度控制的細胞增殖和分化過程, 卻對各種內源和外源氧化性物質很敏感。許多的研究都證實, GSH的濃度、GSH在細胞核的定位與細胞周期的調控、細胞分化密切相關[2]。最新的研究顯示GSH很有可能是一種新的內分泌因子[3]。

生物體內通過谷胱甘肽循環合成和分解谷胱甘肽, 參與谷胱甘肽循環的共有 6個酶, 其中參與谷胱甘肽合成的酶有5羥脯氨酸酶、谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶和轉肽酶, 參與谷胱甘肽分解的酶有谷氨酰環化轉移酶(GGCT)和谷氨酰轉移酶(GGT)。GGCT最早于1972年在大鼠的組織勻漿中發現[4], 近年來發現 GGCT在很多癌組織中有異常高表達, 被認為是一種癌癥標記因子[5]。最近的研究表明, 與胞漿中的 GGCT比較, 在人類尿路上皮細胞, 附睪滋養層細胞, 肺泡Ⅱ型上皮細胞和黏液細胞的細胞核中的 GGCT, 分子量較小, 可能由選擇性剪切或翻譯后加工形成, 作者據此認為定位于細胞核中的GGCT的功能值得深入研究[6]。本實驗室發現, 性腺敗育的轉反義 sGnRH轉基因鯉(Cyprinus carpio )中, 腦部 GGCT的表達水平比對照鯉明顯升高[7]。GGT位于谷胱甘肽循環過程中GGCT的上游, 與GGCT共同參與GSH分解代謝。GGT突變型小鼠表現出嚴重的生殖發育異常, 研究結果證實 GGT對維持小鼠的生殖發育系統中半胱氨酸的正常水平具有非常重要的意義[8]。以上結果均提示GGCT可能除了作為癌癥標記因子外, 還具有不為人所知的重要生物學功能。本研究采用 MO技術在斑馬魚早期胚胎中抑制 GGCT的表達, 同時通過化學阻斷劑阻斷谷胱甘肽循環中GGCT上游的γ谷氨酰轉肽酶(GGT)和下游的5羥脯氨酸酶, 探索了GGCT在斑馬魚早期胚胎發育中的功能。

在人類的相關研究中發現, 谷氨酰胺循環過程中的酶缺陷, 會造成智力低下學習障礙等缺陷[9]。據統計有 10%—30%的谷胱甘肽合成酶缺陷患兒在新生兒期內死亡, 存活下來的一般患有嚴重的智力發育遲鈍[10]。斑馬魚具有體外發育、胚胎透明等特點,本研究將為建立斑馬魚相關疾病模型, 研究和治療GSH代謝異常引起的相關疾病提供新的思路和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用 AB系斑馬魚來自本實驗室, 按斑馬魚手冊養殖規范飼養[11]。魚房恒溫 28.5℃, 光照和熄燈的時間為12h︰12h。用于全胚胎原位雜交的斑馬魚胚胎經過脫膜處理, 在受精 10h后使用0.3 mmol/L 的 1-苯基-2-硫脲(1-phenyl-2-thiourea)抑制黑色素形成。

1.2 MO、mRNA和化學阻斷劑的顯微注射

在本研究中使用的 GGCT-MO及其 5-missmatch 對照均購自Gene Tools公司, GGCT-MO設計為針對ggct基因ATG區阻斷該基因的翻譯過程, 其序列為 5′-AGCTGAGGATCATCCAGGAGCTCAT-3′,5-miss-match MO 的序列為 5′-AGCTCACGATCAT GCAGCACCTCAT-3′。谷氨酰轉肽酶(GGT)化學阻斷劑異惡唑醋酸(Acivicin)購于LKT Laboratories公司[12], 5羥脯氨酸酶(5-oxoprolinase)阻斷劑2-咪唑-4-羧酸乙酯(2-Imidazolidone-4-carboxylate)購于 Sigma公司[13]。構建CMV驅動ggct基因CDS區融合綠色熒光蛋白基因的表達質粒。構建 PCS2-ggct表達質粒, 線性化后用SP6體外轉錄試劑盒(Takara)轉錄出ggct-mRNA。向斑馬魚受精卵注射ggct-GFP質粒, 共注射質粒和GGCT-MO, 質粒和5-miss-match MO檢測MO的有效性; 注射MO, 5-miss-match MO, 共注射MO和ggct mRNA觀察胚胎表型和用于原位雜交檢驗; 注射異惡唑醋酸, 2-咪唑-4-羧酸乙酯觀察胚胎表型。以上化合物均于1細胞期顯微注射于斑馬魚受精卵, 注射濃度為0.5 nmol/μL, 注射量為2 nL/egg。

1.3 全胚胎原位雜交

收集野生型, 注射 MOs化合物, 以及 MO 與ggct mRNA共注射受精后10h、36h與48h斑馬魚胚胎, 于4%多聚甲醛-PBS溶液4℃固定過夜, 實驗步驟根據已有文獻操作[14]。地高辛標記的shha、fgf8、wnt8b探針, 通過斑馬魚腦 cDNA擴增后加 XholⅠ和HindⅢ接頭連接于PCS2+載體內, HindⅢ線性化后使用DIG RNA Labeling Kit (Roche.Indianapols.In.)合成。雜交后的胚胎避光保存在甘油中。

1.4 總谷胱甘肽的含量分析

使用測定 DTNB 方法[15]測定胚胎樣品的谷胱甘肽含量。取GGCT-MO注射, 阻斷劑處理, 以及對照組受精后36h時斑馬魚胚胎各20尾, PBS洗一次,吸盡上清, 加入100 μL蛋白去除劑M溶液(GSH 和GSSG Assay Kit, 碧云天, 上海), 使用勻漿器充分勻漿, 混合后 4℃放置 5min, 4℃, 10000×g離心10min。通過谷胱甘肽還原酶把GSSG還原成GSH,而和生色底物DTNB反應產生黃色的TNB和GSSG,從而通過測定A412就可以計算出總谷胱甘肽的量。用GSH清除試劑先清除樣品中的GSH, 然后利用上述反應原理就可以測定出GSSG的含量。用總谷胱甘肽(GSSG+GSH)的量扣除 GSSG 的含量, 就可以計算出GSH的含量。

2 結果

2.1 GGCT-MO有效性檢測

本研究構建了CMV驅動ggct基因CDS區融合綠色熒光蛋白基因的表達質粒與 GGCT-MO共注射斑馬魚胚胎的方法, 檢測GGCT-MO和其對照MO阻斷ggct基因翻譯的有效性。在斑馬魚受精卵發育10h時, 于熒光顯微鏡下觀察到的結果如圖1所示, 單獨注射ggct綠色熒光蛋白表達質粒(圖1A)和質粒與對照MO共注射(圖1C)時胚胎均正常表達綠色熒光, 而質粒與 GGCT-MO共注射(圖 1B)時不能表達綠色熒光, 說明GGCT-MO能有效的抑制ggct翻譯的起始。

2.2 GGCT-MO注射對早期斑馬魚胚胎發育的影響

向受精后處于1細胞期的斑馬魚胚胎顯微注射GGCT-MO, 比較野生型和注射 GGCT-MO與對照MO后的斑馬魚胚胎, 如圖2所示, GGCT-MO注射會導致33.33%的斑馬魚體型短小、體節發育異常和尾短彎曲(圖2A、圖3B)。53.88%的斑馬魚頭部發育緩慢(圖2B、圖3B)。12.97%的斑馬魚心血管系統出現多種形態改變, 包括卵黃水腫, 環心室水腫, 心臟畸形, 心臟線性化(圖 2C-D、圖 3B)。MO 敲降GGCT后斑馬魚早期胚胎發育的總畸形率為72.25%,死亡率為 9.09%(圖 3A)。ggct-mRNA與 GGCT-MO共注射, 斑馬魚早期胚胎發育的死亡率為 2.37%,總畸形比例為 32.6%(圖 3A); 其中體節畸形比例下降為3.6%, 腦發育畸形比例下降為30.25%, 未出現圍心腔水腫表型(圖3B)。

分別收集受精后發育10h、36h與48h的三個發育時期胚胎, 使用全胚胎原位雜交的方法(In situ hybridization)檢測腦部發育標志因子 shha、fgf8、wnt8b的表達變化, 結果如圖4所示, GGCT-MO的注射影響這些因子的表達, 注射GGCT-MO后shha和wnt8b表達量增多(圖4A-C、E-G、M-O), fgf8表達量減少(圖4I-K)。ggct-mRNA與GGCT-MO共注射胚胎在受精后36h和48h, 標記基因fgf8和wnt8b的變化趨勢減弱(圖4K-L、O-P)。

圖1 GGCT-MO及對照MO的有效性檢測Fig. 1 Efficiency of GGCT-MO and control MO

圖2 MO注射斑馬魚早期胚胎產生的表型Fig. 2 Abnormal embryos caused by MO microinjection

圖3 MO與對照注射后斑馬魚胚胎的畸形比例Fig. 3 Abnormal embryos ratio caused by MOs and control injection

阻斷GGCT上游的g 谷氨酰轉肽酶和下游的 5羥脯氨酸酶, 同樣以顯微注射的方式處理斑馬魚胚胎。谷氨酰轉移酶阻斷劑處理斑馬魚胚胎發育緩慢, 79%的胚胎停留在bud時期之前(圖5B-C), 5羥脯氨酸酶處理斑馬魚胚胎出現圍心腔水腫(圖5E-F), 畸形率為62%。

2.4 MOs和化學阻斷劑注射胚胎的谷胱甘肽檢測

圖4 GGCT-MO注射影響腦發育相關因子的表達Fig. 4 GGCT-MO injection affects expression of some marker genes of brain development

圖5 化學阻斷劑處理后斑馬魚早期胚胎產生的表型Fig. 5 Abnormal embryos caused by chemical blockers microinjection

檢測GGCT-MO注射和阻斷劑處理斑馬魚胚胎的總谷胱甘肽含量(圖 6)和還原型谷胱甘肽含量(圖7), 結果表明MOs和化學阻斷劑處理胚胎的總谷胱甘肽含量均約為59.3 nmol/μL, 無明顯區別。GGCTMO注射和GGT的化學阻斷都能導致胚胎GSH含量的顯著減少(n=6, P<0.05), 野生型胚胎GSH含量為 57.96 nmol/μL, MO注射后胚胎的 GSH含量為55.73 nmol/μL, GGT阻斷后的胚胎 GSH 含量為55.75 nmol/μL, cMO注射和5羥脯氨酸酶阻斷的胚胎GSH含量為60 nmol/μL, 與野生型差異不顯著。

3 討論

3.1 敲降ggct影響斑馬魚背腹軸和腦部發育

圖6 MOs注射和阻斷劑處理胚胎的總谷胱甘肽含量Fig. 6 The total GSH/GSSG concentration of embryos treated with MOs and chemical blockers

圖7 MOs注射和阻斷劑處理胚胎的GSH含量(n=6, “*”P<0.05)Fig. 7 The GSH concentration of embryos treated with MOs and chemical blockers

敲降ggct表達, 斑馬魚胚胎出現頭部發育緩慢,體節彎曲, 圍心腔水腫等異常發育表型。在胚胎發育的過程中, 各種細胞沿著前-后軸, 背-腹軸特化形成不同的組織和器官。軸的特化過程是各種基因相互作用的結果[16]。在敲降ggct導致的各種異常表型中, 腦部發育異常所占比例最高(53.88%), 據此我們選擇了控制腦部發育的標記基因 shha、fgf8和wnt8b研究ggct敲降后的表達變化。shha表達于軀體中線, 控制頭部結構和發育, 引導中樞神經板形成, 并參與早期胚胎發育的多個過程[17]。fgf8是一種重要的纖維母細胞生成因子, 在腦部中集中表達,抑制細胞背部化命運[18]。wnt8b在腦部區域的表達促進細胞背部化, 抑制腹部化命運[19]。研究發現,敲降ggct導致斑馬魚背部化因子wnt8b增加, 而抑制背部化的fgf8表達減少, shha表達量增加, 說明敲降ggct影響了斑馬魚早期胚胎的背腹軸形成及腦部發育。采用 ggct-mRNA與MO共注射, 發現斑馬魚胚胎的死亡率由 9.09%下降為 2.37%, 總畸形率由72.25%下降為 32.6%, 其中腦部發育畸形胚胎比例由53.88%下降為30.25%, fgf8、shha、wnt8b表達的變化趨勢減弱, 證明注射 GGCT-MO對斑馬魚早期胚胎的背腹軸形成和腦部發育的影響是由ggct的敲降引起。

3.2 敲降ggct影響GSH的分解代謝

為了進一步研究敲低 GGCT-MO后, 斑馬魚胚胎出現的異常發育表型以及腦部發育相關因子的表達變化是由于MO對ggct基因翻譯的阻斷引起, 而非由于 MO的毒性和非靶標的效應造成的結果, 我們使用化學阻斷劑阻斷谷胱甘肽循環過程中 GGCT上游的ggt基因和GGCT下游的5羥脯氨酸酶基因的表達。發現阻斷 ggt基因的表達后出現斑馬魚胚胎發育停滯, 79%的胚胎停留在 bud時期之前, 且GSH含量明顯下降; 阻斷5羥脯氨酸酶基因62%的斑馬魚胚胎出現圍心腔水腫, GSH含量無明顯改變。GGT與 GGCT共同參與 GSH的分解代謝, 敲降GGCT胚胎GSH含量同樣明顯下降, 5羥脯氨酸酶分解5羥脯氨酸釋放谷氨酸用于GSH合成, 已有研究證實由于谷氨酸可以由其他途徑獲得, 阻斷 5羥脯氨酸酶不影響GSH循環[20], 說明阻斷5羥脯氨酸酶造成的圍心腔水腫可能由于氧化性損傷造成, 而敲降GGCT和阻斷GGT對斑馬魚早期胚胎發育遲緩和發育停滯可能通過影響 GSH的正常分解代謝而實現。

r谷氨酰環化轉移酶是谷胱甘肽循環過程中參與谷胱甘肽分解的關鍵酶, 近年來有研究提示GGCT可能具有重要的生物學功能, 但未見任何相關報道。本研究以斑馬魚為模型, 通過敲降ggct基因的表達并進行拯救實驗, 采用化學阻斷劑阻斷谷胱甘肽循環等處理, 發現谷氨酰環化轉移酶在斑馬魚早期胚胎發育中具有重要作用。