鎘對河南華溪蟹卵黃磷蛋白在卵巢中表達含量的影響及ELISA法的建立

楊 健 劉冬梅 何永吉 漢斯·達姆斯 王 蘭

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鎘對河南華溪蟹卵黃磷蛋白在卵巢中表達含量的影響及ELISA法的建立

楊 健1劉冬梅2何永吉1漢斯·達姆斯3王 蘭1

(1. 山西大學生命科學學院, 太原 030006; 2. 山西醫科大學基礎醫學院, 太原 030006; 3. 高雄醫學大學生命科學院, 高雄 80708)

為了探究鎘對河南華溪蟹()的卵子發生的影響, 通過凝膠過濾層析法純化了成熟卵巢中的卵黃磷蛋白(Vitellin, Vn), 采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳確定了Vn亞基數量及分子量, 以純化的Vn為抗原制備了Vn多克隆抗血清并建立了可靠的Vn含量測定的ELISA方法。采用氯化鎘體外亞慢性染毒的方法, 運用Vn-ELISA方法檢測鎘暴露對卵巢組織中Vn含量的影響。實驗設對照組和5.8 mg/L鎘處理組, 處理時間分別為10、15和20d。結果顯示, (1) SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結果表明該蛋白由分子量為102、84和70 kD的3個亞基組成, 同時Western-blotting檢測表明, 抗血清對該蛋白具有較強的免疫特異性; (2) 在Vn-ELISA中, Vn抗體最佳稀釋倍數為1︰100000, 該方法的工作濃度范圍為125—2000 ng/mL, 定性檢測的靈敏度可達到15.62 ng/mL; 卵巢中Vn含量測定的結果中各批次間沒有顯著差異, 且平均變異系數分別僅為7.81%, 表示該法具有較高的穩定性和重復性; (3) 鎘引起卵巢組織中Vn含量的顯著降低, 與鎘處理時間具有時間-效應關系, 說明了鎘暴露可影響河南華溪蟹卵母細胞的成熟并對卵子發生產生抑制作用, 進而影響卵巢的正常發育。

河南華溪蟹; 卵黃磷蛋白; SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳; 酶聯免疫吸附法; 鎘

鎘在工業中的大量使用導致其成為環境中大量存在的非必需金屬元素之一, 同時也成為水體污染中一類典型的環境污染物。本實驗室早期研究發現鎘可以在河南華溪蟹()卵巢、肝胰腺、鰓以及肌肉等組織中富集, 導致生物體產生急性或慢性中毒, 造成組織器官出現不同程度的損害, 如鎘誘導的細胞壞死、細胞凋亡和脂質過氧化反應[1—4]。韓托等[5]研究發現在鎘富集的水域生物個體大量死亡, 這直接導致水生生物種群數量和生物多樣性顯著降低。此外, 研究發現鎘會對魚類、蟹類和鳥類的脂質、糖類和蛋白質代謝產生影響, 從而影響物種的遷徙和繁殖[6—8]。同時由于鎘的半衰期較長, 通過消化及呼吸系統進入機體后造成的損傷是永久的, 這將會長期影響水生環境中物種的繁殖過程進而影響生物種群及生態系統, 因此探究可反映污染物對生物早期影響的繁殖參數是水生生態毒理學研究中急需要解決的問題。

卵子發生是甲殼動物卵巢發育中的一個重要階段, 表現為卵母細胞中卵黃蛋白原(Vitellogenin, Vg)的形成和積累[9]。在卵巢中, Vg會通過進一步的修飾和加工形成包含有Vg、脂類、碳水化合物和色素等物質的卵黃磷蛋白(Vitellin, Vn), 并在卵母細胞中積累形成卵黃體。Vn是甲殼動物卵子存活和胚胎發育所需營養物質的主要來源, 卵巢中Vn積累的多少直接影響到其后生殖過程和幼體質量。因此, Vn可作為研究甲殼動物繁殖的重要生物指標[10]。此外, 甲殼動物的卵黃發生過程由于受內分泌系統、外部環境的調節而具有較高的復雜性, 目前對其內在的調控機制研究已成為甲殼動物研究熱點和難點之一[11, 12]。甲殼動物Vn已有的研究發現, Vn含量與卵巢發育階段具有一定的相關性, 因此機體組織中Vn含量測定對于研究鎘對甲殼動物卵巢發育和卵子發生的影響具有重要意義。

酶聯免疫吸附法(Enzyme-linked immunoabsor-bent assay, ELISA) 已被廣泛用于甲殼動物Vn含量的測定[13, 14]。不同的甲殼動物在Vn亞基數目、空間結構和分子量上通常存在一定差異, 因此需要針對不同物種制備具有特異性的Vn抗體, 并在此基礎上建立適合該物種Vn-ELISA方法, 為進一步研究甲殼動物卵黃發生及鎘對卵巢發育的影響提供重要依據。目前, 對于甲殼動物卵子發生和鎘對卵巢發育的影響已進行了較為廣泛的研究[13—16]。然而河南華溪蟹在這方面的研究少有報道。因此, 當前迫切需要建立一種較為可靠的方法以測定鎘處理后河南華溪蟹卵巢中Vn含量。本研究分離并純化了河南華溪蟹的Vn, 制備了Vn多克隆抗體, 優化了Vn測定的ELISA參數, 該方法不僅可以用于研究鎘對河南華溪蟹卵巢中卵子發生的影響, 還可作為深入研究河南華溪蟹生殖調控和環境監測的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

河南華溪蟹(簡稱“溪蟹”)于2013年10月購自山西省太原市五龍口水產批發市場。選取卵巢發育成熟的雌蟹置于實驗室水族缸中暫養三周后進行活體解剖后將卵巢保存于–80℃冰箱中備用。

1.2 卵黃磷蛋白分離和純化

卵巢粗提液的制備溪蟹成熟卵巢中加入10倍體積預冷的勻漿緩沖液(0.02 mol/L Tris-HCl, 0.1 mol/L NaCl, 0.01% EDTA, 0.1 mmol/L PMSF)冰浴勻漿, 在4℃12000×下離心30min后取橘黃色上清液并加入等體積的飽和硫酸銨溶液, 冰浴1h后再次在4℃12000×下離心30min, 棄上清液, 向離心管中加入2 mL的PBS緩沖液(0.1 mol/L KH2PO4, 0.1 mol/L Na2HPO4·12H2O, 0.1 mol/L NaCl, 0.1 mol/L KCl, 0.01% EDTA, pH 7.7)溶解沉淀, 然后重復“沉淀-離心-復溶”的步驟5次, 最后將沉淀物溶解于1 mL PBS緩沖液中用于凝膠過濾層析分離純化蛋白。

卵黃磷蛋白提取采用凝膠柱體積為260 mL (直徑×高度=2.6 cm×100 cm, 上海廈美生物科技發展有限公司生產), 裝入220 mL凝膠(型號SephacrylTMS 100 HR, 瑞典Pharmacia公司生產), 純化前首先采用PBS緩沖液溶液平衡凝膠柱, 流速16 mL/h, 平衡1h。用注射器上樣2 mL Vn提取液, 流速為16 mL/h, 使用UVD-680-3紫外檢測器(上海金達生化儀器廠)在280 nm條件下檢測洗脫液的吸收值。當出現蛋白組分時開始收集, 每2 mL收集1管, 洗脫液于–80℃保存備用。使用SpectraMax M5多功能酶標儀(美國Molecular Devices分子儀器公司)對提純后的卵黃蛋白溶液進行連續光譜掃描(700—200 nm)以檢測類胡蘿卜素。

1.3 卵黃磷蛋白亞基數量及分子量分析

將純化蛋白進行變性聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE, 分離膠質量濃度為10%, 濃縮膠質量濃度為5%), 然后用考馬斯亮藍R-250染色后, 在Tanon-2500 (上海天能公司)凝膠成像儀拍照, 通過與蛋白標準比對并采用BandScan 5.0軟件以確定溪蟹Vn各亞基的分子量。

1.4 抗體制備和免疫印跡

選用6—8周齡雌性BALB/c小鼠作為免疫動物, 暫養1周后將純化的Vn溶液與QuickAntibody等體積混合后用于免疫注射。每只小鼠于后腿小腿肌肉首次免疫注射100 μL (免疫抗原量25 μg)的抗原乳化液, 此后第21天再次注射100 μL抗原乳化液進行加強免疫, 第35天小鼠摘除眼球取血, 室溫靜置1h待血液凝固后, 于4℃12000×離心10min后取上清, 加入0.02% NaN3, 無菌分裝于–80℃。

采用蛋白免疫印跡(Western-Blotting)檢驗抗體和抗原免疫反應的特異性。首先將純化的Vn進行SDS-PAGE電泳, 電泳條件同前。電泳結束后的凝膠在72 V電壓下轉膜1h。將鼠多克隆抗體按 1︰5000稀釋, 加樣體積為1 mL, 室溫孵育1h; 加入1︰2000稀釋的羊抗鼠IgG-IRP(Catalog No. HSA0004, 上海麥約爾生物技術有限公司生產)作為二抗, 室溫孵育1h后用1 mL PBST (10 mmol/L PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.2)洗滌3次, 每次10min; 采用DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒(德國Roche公司)顯色3min后采用Tanon-2500凝膠成像儀拍照。

1.5 Vn抗體效價檢測和Vn-ELISA建立

采用間接包被法ELISA確定鼠多克隆Vn抗體的有效稀釋倍數并建立Vn-ELISA標準曲線。主要包括抗原包被、封閉、加抗體、顯色、反應終止和讀數等步驟。(1)包被: 將純化的Vn用包被緩沖液(0.05 mol/L Na2CO3, 0.05 mol/L NaHCO3, pH=9. 6)溶解成1 μg/mL, 然后按每孔100 μL進行包被, 4℃過夜后去除包被液; (2)封閉: 用200 μL的PBST重復清洗3次后, 每孔加入200 μL的封閉液(1%牛血清白蛋白)封閉2h, 然后用PBST洗滌3次; (3)加抗體: 將純化后的Vn抗血清按1︰1000、1︰10000、1︰100000和1︰20000用1%的BSA進行稀釋, 每孔加樣100 μL, 同時以不含Vn抗體的1% BSA為陰性對照, 37℃反應2h, 每孔用200 μL PBST洗滌3次后加100 μL稀釋的羊抗鼠IgG-HRP作為二抗, 37℃放置1h后用PBST洗滌3次; (4)顯色: 加入100 μL TMB顯色液(北京索萊寶科技有限公司), 室溫避光放置30min; (5)反應終止: 加50 μL終止液(2 mol/L H2SO4溶液); (6)讀數: 采用SpectraMax M5多功能酶標儀測定450 nm的吸光度。

在上述實驗的基礎上進行標準曲線制備, Vn稀釋液的質量濃度分別為7.81、15.62、31.25、62.5、125、250、500、1000、2000和4000 ng/mL, 每個質量濃度組各重復3孔, 同時設置3個陰性對照, 在酶標儀上讀取450。根據線性關系和變異系數, 選取具有良好重復性和質量濃度相關性的Vn濃度范圍繪制標準曲線。

1.6 驗證性實驗

隨機選擇5只雌性溪蟹, 分別稱重0. 1 g左右的卵巢組織, 加入10倍體積預冷的勻漿緩沖液進行勻漿, 將勻漿液在4℃、12000×下離心15min, 取上清液0.1 mL用于ELISA測定。將勻漿液用包被緩沖液稀釋后用于ELISA測定; 該實驗重復進行3次, 然后分析批次間的誤差及變異系數, 從而驗證本實驗建立ELISA方法的可靠性和穩定性。

1.7 樣本染毒處理

選取處于卵巢發育期的成年雌性溪蟹進行染毒處理。實驗設對照組和5.8 mg/L鎘染毒組, 體外暴露10、15 和20d后取樣。各染毒時間組隨機選取5只溪蟹迅速解剖, 取出卵巢組織后采用Vn- ELISA法以測定其Vn含量。每個實驗進行3次獨立的重復。

1.8 數據分析

采用SPSS 17.0軟件(SPSS Inc., Chicago, USA)對實驗數據進行統計分析, 數據采用平均值±標準差表示。分別采用Kolmogorov-Smirnov和Levene法進行數據分布和方差齊性檢驗, 采用單因素方差分析中的Dunnett’s post-hoc 法對實驗結果進行方差分析。采用Test (independent samples Test)比較不同Vn抗體稀釋倍數、不同Vn質量濃度和不同測定批次對結果是否存在顯著差異, LSD法進行染毒組與對照組兩兩比較, 以<0.05為差異顯著標準。

2 結果

2.1 河南華溪蟹Vn的分離純化和亞基組成

溪蟹卵巢勻漿液凝膠柱層析結果顯示成熟卵巢勻漿液主要含有1個蛋白質峰, 洗脫時間在175—190min時該蛋白組分大量被洗脫出峰。由于甲殼動物卵黃磷蛋白含有較多類胡羅卜素, 連續光譜掃描的結果顯示卵黃磷蛋白在470 nm處有明顯的光吸收, 故該蛋白峰可能為溪蟹的Vn。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對該蛋白的進一步分析發現(圖1), 該蛋白由3個亞基組成, 他們的分子量分別為102、84和70 kD。進一步通過WesternBlotting實驗表明, 該蛋白及3個蛋白亞基均可與溪蟹Vn的多克隆抗體產生特異性免疫反應(圖1)。

1. 標準蛋白; 2. 卵黃磷蛋白0.6 mg/mL; 3. 卵黃磷蛋白 0.8 mg/mL; 4. 卵黃磷蛋白Western-blotting

1. Molecular mass markers; 2. vitellin 0.6 mg/mL; 3. vitellin 0.8 mg/mL; 4. Vn Western-blotting

2.2 河南華溪蟹Vn抗體效價檢測及標準曲線優化

由表1可見不同稀釋倍數的溪蟹Vn抗體對ELISA讀數的影響?？贵w稀釋1000—200000倍時,450讀數均顯著高于陰性對照且各濃度組差異顯著。同時抗體稀釋20萬倍時,450讀數與陰性對照呈顯著性差異, 這說明該抗體具體較高的效價。由于抗體稀釋10萬倍時,450的差異系數僅為4.18%均低于各組, 因此本實驗條件下的Vn抗血清最佳稀釋倍數為1︰100000。在上述優化的Vn抗血清條件下, 將不同質量濃度的Vn包被液按樣品直接包被法測定450值。

表1 河南華溪蟹Vn抗體不同稀釋倍數的ELISA反應的A450值

注: 同列數據肩標含有不同上標字母為差異顯著 (< 0.05);代表樣品量, 下同

Note: Values within a column having different superscript letter are significantly different (< 0.05);means sample number. The same applies bellow

表2結果顯示在Vn濃度在7.81—4000 ng/mL時,450值差異顯著。由于Vn質量濃度為7.81 ng/mL時,450值與陰性對照相比不存在顯著差異。而當Vn質量濃度為15. 62 ng/mL時,450值顯著高于7.81 ng/mL濃度組和陰性對照, 因此該方法檢測Vn可檢出值為15. 62 ng/mL左右。

表2 不同Vn質量濃度的A450值

Vn質量濃度在7.81—62.5 ng/mL時,450的變異系數較大不符合標準曲線的要求, 且在4000 ng/mL與2000 ng/mL Vn濃度組相比,450值不存在顯著差異, 因此選擇Vn質量濃度為125、250、500、1000和2000 ng/mL制作標準曲線。圖2結果表明在該范圍內Vn質量濃度和450線性關系良好(= 0. 0008+ 0. 5565,2=0. 9763,< 0. 001,和分別代表Vn質量濃度和450), 且各點的變異系數較低, 因此該標準曲線的重復性和線性相關性均符合要求, Vn工作濃度范圍為125—2000 ng/mL。

2.3 驗證性試驗

根據建立的Vn-ELISA標準曲線, 隨機取5只雌性溪蟹的卵巢組織進行驗證性試驗并重復3次。表3為驗證性試驗的結果, 批次間平均變異系數僅為7. 81%。批次間測定的Vn含量無顯著差異, 因此本實驗建立的ELISA測定方法具有較高的穩定性和可重復性。

表3 河南華溪蟹卵巢中Vn的含量

2.4 鎘對河南華溪蟹卵巢中Vn含量的影響

圖3所示, 鎘染毒后, 各處理組卵巢中Vn含量與對照組比較有顯著性降低(< 0.05), 隨著處理時間的延長, 卵巢中Vn含量呈現逐漸降低的趨勢, 并在鎘處理20d染毒組中達到最低值(31.42 ± 7.25) mg/g。

3 討論

在大多數的甲殼動物中僅存在一種形式的卵黃磷蛋白[17, 18], 然而Serrano-Pinto等[19]和Laino等[20]的研究發現了兩種存在形式的卵黃磷蛋白。在本研究中, 通過凝膠過濾層析法純化了溪蟹成熟卵巢中的Vn。在經過SDS處理后發現該蛋白分成3條多肽鏈, 分子量分別為102、84和70 kD, 并且各亞基彼此差異明顯, 這與其他甲殼動物的研究結果存在一定的差異。大量研究表明甲殼動物卵黃磷蛋白的分子量通常在200—700 kD, 且多由2—6個亞基組成, 如中華絨螯蟹()卵黃磷蛋白的分子量為520 kD, 兩種亞基的分子量分別為97和74 kD[13]; 銹斑()Vn兩個亞基分子量分別為105和76 kD[21]; 陸蟹() 3個亞基分子量分別為115、105和85 kD[22]; 日本沼蝦() 3個亞基分子量分別為110、96和89 kD[23]; 三疣梭子蟹卵黃磷蛋白的亞基數為三個, 分子量分別為100、75和66 kD[14]; 克氏原螯蝦()Vn分子量為481 kD, 有六個亞基 (198、176、132、111、92、82 kD)[24]。

以分離純化后的溪蟹Vn為抗原, 制備了相應的Vn抗血清。Western-blotting實驗表明該抗血清可以特異地識別溪蟹中的Vn。這種較高的特異性確保該抗體可用于溪蟹體內Vn的免疫學研究以建立一種Vn-ELISA法定量測定組織中的Vn的含量。當前的研究表明本文建立的Vn-ELISA法具有較高的靈敏度, 最低可檢測到15.62 ng/mL的Vn, 其最佳的工作濃度范圍為125—2000 ng/mL。而在其他甲殼動物中, 由Vn特異多抗血清建立的Vn-ELISA研究結果與本文的基本類似。Volz等[25]在對橈足類動物的研究中建立Vn-ELISA工作范圍為31—1000 ng/mL, 精度為1.9 ng/mL。在中華絨螯蟹的研究中, Chen等建立了一個類似的Vn-ELISA, 其測定范圍為8—500 ng/mL[13]。牡蠣()Vn-ELISA系統中的工作濃度為 10—400 ng/mL[26]。驗證性實驗結果顯示出本實驗所建立的河南華溪蟹Vn-ELISA法在批次內和批次間不存在顯著性差異, 同時具有較低的差異系數, 因此該法具有較高的穩定性和可重復性。與當前已經發表的研究結果比較, 本實驗所建立的Vn-ELISA工作范圍是可信和敏感的。該法所具有的較高的精確度使得可以在不同時間直接進行樣本間卵黃磷蛋白含量的比較。為了使該法可以應用與不同卵黃磷蛋白濃度的測定, 本文將純化好的卵黃磷蛋白稀釋為不同的濃度以建立一條標準曲線, 這樣可以定量測定在經過鎘處理后溪蟹組織中的卵黃磷蛋白。本實驗結果發現, 在經過鎘的亞慢性染毒處理之后, 溪蟹卵巢中的Vn含量顯著降低, 這表明鎘暴露可抑制溪蟹中Vn的合成和積累。本實驗室早期研究發現鎘處理后溪蟹卵巢指數顯著降低, 并認為這可能是溪蟹體內存儲的大量能量物質被分解以用于能量合成的結果[27]。Vn作為溪蟹卵巢中重要的營養物質, 它的減少則可能是導致卵巢發育異常的重要原因。Revathi等和Rodriguez等研究認為鎘對Vn合成的抑制作用可導致卵巢中卵母細胞直徑減小, 這可延緩卵母細胞的成熟和卵子的發生, 進而影響卵巢的正常發育和種群的繁殖[28, 29]。

在大部分的昆蟲中, 卵黃磷蛋白在卵巢外先合成為卵黃磷蛋白的前體蛋白, 然后通過血液循環系統輸送到卵巢, 然后被卵母細胞吸收。當前關于甲殼動物卵黃蛋白原的合成位點還沒有搞清楚, 一直都是研究的熱點。關于十足類甲殼動物Vg合成部位的研究結果顯示, 肝胰腺和卵巢是公認的主要的合成部位, 其次是血細胞和皮下脂肪體, 因此在甲殼動物中Vg的合成可能是內源的或外源的或兩者兼有。在一些種類中, Vg在卵巢中合成, 如短溝對蝦()[30]。而在另一些甲殼動物種類中, Vg在肝胰腺中合成, 如一種溪蟹()[31]。對于不同種甲殼動物, Vg合成部位的研究結果不盡相同。當前關于河南華溪蟹卵黃磷蛋白的研究較少, 因此, 可以在本文研究的基礎上, 進一步探討河南華溪蟹卵黃發生部位和鎘對Vn合成影響的機理。

致謝:感謝鄒恩民教授對論文的修改給予的指導幫助。

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ESTABLISHED OF ELISA METHOD OF VITELLIN FROM FRESHWATER CRAB () AND EFFECT OF CADMIUM ON VITELLIN ACCUMULATION IN OVARY

Yang Jian1, Liu Dong-mei2, He Yong-ji1, Hans-Uwe Dahms3and Wang Lan1

(1. School of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China; 2. School of Basic Medical,Shanxi Medical University, Taiyuan 030006, China; 3. School of Life Science, Kaohsiung Medical University, Kaohsiung 80708,Taiwan, China)

To explore the effect of cadmium (Cd) on oogenesis of freshwater crab (), vitellin (Vn) and the method of Vn-ELISA was studied and established. Vn was purified from mature ovaries ofby gel filtration chromatography. Using SDS- polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), the molecular weight and the quantity of Vn subunit were determined. Based on the purified Vn and Vn anti-serum, the reaction parameters for an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed. To explore the effect of cadmium on the Vn in the ovaries, freshwater crab.weretreated with 5.8 mg/L Cd for 10, 15, and 20d. The results showed that Vn was composed of three subunits (116, 66 and 45 kD). Western-blotting confirmed the polypeptides had a specific reactivity with mouse polyclonal Vn anti-serum. The optimal dilution rates of Vn anti-serum were shown to be 1︰100000. According to these optimal parameters, the standard linear equation was established for the determination of Vn concentration with a valid range of 125—2000 ng/mL, and qualitative detection can be 15.62 ng/mL. In verification experiments, Vn content in the ovaries showed no significant differences, and the mean coefficients of variation of inter-assay were 7.81%, suggesting that the developed ELISA of this study was precise, stable and repeatable. Moreover, Cd caused a time-dependend down-regulation of Vn level, and showed significant effects of Cd on vitellogenesis, which suggest that Cd slows down oocyte maturation and vitellogenesis in

; Vitellin; SDS-polyacrylamide gel electrophoresis; Enzyme-linked immunosorbent assay; Cadmium

10.7541/2015.38

X174

A

1000-3207(2015)02-0287-07

2014-09-04;

2014-12-07

國家自然科學基金(No. 30870267, No. 30970361); 山西省回國留學人員科研項目(No. 2010015); 山西省普通高校特色重點學科建設項目(No. 2011-SXDX-SWX-003)資助

楊健(1988—), 男, 山西長治人; 博士; 主要從事環境重金屬污染研究方向。E-mail: yangjian333001@126.com

王蘭(1960—), 女, 山西太原人; 教授; 主要從事典型重金屬污染的細胞與分子機制研究方向。E-mail: lanwang@sxu.edu.cn