達氏鱘生長激素基因cDNA克隆、表達及免疫熒光定位研究

單喜雙 岳華梅 陳細華 葉 歡 楊曉鴿 李創舉

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達氏鱘生長激素基因cDNA克隆、表達及免疫熒光定位研究

單喜雙1, 2岳華梅1陳細華1葉 歡1楊曉鴿1李創舉1

(1. 中國水產科學研究院長江水產研究所, 農業部淡水生物多樣性保護重點實驗室, 武漢 430223; 2. 上海海洋大學水產與生命學院, 上海 201306)

為研究達氏鱘()生長激素(Growth Hormone, GH)基因的功能, 合成了達氏鱘垂體SMART cDNA, 克隆得到全長cDNA序列。達氏鱘全長cDNA序列為1008 bp, 由52 bp的5′端非編碼區(Untranslated region, UTR)、編碼214個氨基酸的645 bp開放閱讀框(Open reading frame, ORF)和311 bp的3′UTR構成。運用GH氨基酸序列構建進化樹分析發現, 達氏鱘與兩棲類、爬行類和哺乳類的一致性要高于真骨魚類。實時熒光定量PCR結果表明, 達氏鱘mRNA主要在垂體和下丘腦中表達, 且垂體中的表達量約為下丘腦的110倍; Western-blot研究結果與qRT-PCR一致, 僅在垂體和下丘腦中檢測到生長激素蛋白, 且垂體中GH的表達量遠高于下丘腦。免疫熒光定位結果顯示, GH主要定位于垂體中部, 下丘腦中也有少量熒光信號; 蘇木精-伊紅組織切片染色研究表明, GH主要是由嗜酸性的生長激素分泌細胞分泌。研究為深入研究脊椎動物生長激素基因的進化和人工養殖達氏鱘的生長調控提供了基礎。

達氏鱘; 生長激素; qRT-PCR; Western-blot; 熒光免疫組化

鱘是最古老的脊椎動物之一, 已生存超過2億年, 具有重要的進化地位。達氏鱘()為我國長江上游特有的淡水定居型魚類, 與長江中另外兩種鱘中華鱘()和白鱘()相比, 其個體較小, 性成熟年限相對較短(雌性5—7齡, 雄性3—5齡)。歷史上達氏鱘曾是長江上游重要的經濟魚類之一, 20世紀70年代以來, 由于水利水電工程建設、航運、水體污染和過度捕撈等人類活動的影響, 達氏鱘生存環境遭到嚴重破壞, 物種處于極度瀕危狀況, 已于1988年被列為國家一級保護動物[1—3]。目前對于達氏鱘的保護主要采用建立自然保護區、禁漁、增殖放流等方式[4], 取得了一定的成效, 特別是達氏鱘規?；斯し敝臣夹g的突破, 對于延續達氏鱘物種有重要意義。但是, 人工養殖達氏鱘仍然面臨生長發育較慢和初次性成熟時間較長等問題, 限制了其資源恢復, 尋找合適的方式促進達氏鱘的生長發育對其物種保護和資源利用具有重要的意義。

魚類生長激素是由腺垂體分泌的一類具有廣泛生理作用的單鏈多肽, 腺垂體分泌的生長激素通過下丘腦-垂體-肝臟生長調控軸, 刺激肝臟分泌胰島素樣生長因子I(IGF-I), 通過IGF-I受體的介導來發揮生物學功能[5—9]。生長激素的分泌受到下丘腦分泌的生長激素釋放激素、促性腺激素釋放激素和生長激素抑制激素的調控, 研究顯示生長激素不僅在魚類的生長調控方面起主要作用, 與魚類的生殖[10, 11 ]、免疫[12]、滲透壓[13]等生理活動的調節也息息相關。由于生長激素在魚類生長和發育過程中的重要作用, 引起了科研工作者和漁業生產者的普遍關注, 20世紀80年代中期開始國內外很多實驗室對魚類的生長激素基因進行了研究, 如中華鱘、俄羅斯鱘()、歐洲鰉()、波斯鱘()大馬哈魚()、虹鱒()、草魚()、南方鲇()、黃鱔()和泥鰍()、鯽()等[14—22]。具有快速生長特征的轉生長激素基因魚于1984年在我國首次誕生[23], 迄今已在世界范圍內成功獲得了幾十種轉基因魚。此外, 利用基因工程方法對外源生長激素基因進行基因重組, 構建原核和真核表達系統, 獲得重組生長激素通過投喂或者注射的方式促進魚類生長的研究也比較多[24]。魚類生長激素的研究近幾十年來在國內外逐漸開展并取得顯著進展, 在未來的很長一段時間內仍是熱點。

本研究克隆了達氏鱘生長激素全長cDNA序列, 利用實時熒光定量PCR (Quantitative real-time poly-merase chain reaction, qRT-PCR)和Western-blot方法研究了達氏鱘不同組織中生長激素mRNA及蛋白質水平的表達情況; 隨后采用熒光免疫組織化學方法對垂體和下丘腦中生長激素分泌細胞進行定位, 并用HE染色的方式對其分泌細胞進行辨別。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗魚取自中國水產科學研究院長江水產研究所太湖試驗場(湖北荊州), 為全人工繁殖的一齡子二代達氏鱘。分別取肝、脾、心、性腺、脂肪、腎、肌肉、腸、垂體、下丘腦、端腦、中腦、小腦和延腦等組織, 在液氮中速凍后, 存放于–80℃備用。本研究中所用GH多克隆抗體依據中華鱘GH氨基酸序列制備, 為中國科學院水生生物研究所桂建芳院士贈送。

1.2 總RNA提取、單鏈cDNA及SMART cDNA合成

總 RNA參照SV Total RNA Isolation System (Promega, 美國)試劑盒說明書提取; 利用PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser (TaKaRa, 日本)試劑盒合成第一鏈cDNA用于qRT-PCR實驗, 按 Super SMART?PCR cDNA Synthesis Kit 操作手冊的方法合成達氏鱘垂體SMART cDNA。

1.3 達氏鱘基因全長cDNA克隆及序列分析

參考中華鱘基因cDNA序列(GenBank登錄號: EU599640.2)設計引物-F和-R(表1)進行PCR擴增反應, 克隆獲得部分達氏鱘cDNA序列, 根據該序列設計特異引物5′-R15′- R23′-F13′-F2擴增cDNA5′端和3′端, 擴增產物純化后連入pMD19-T載體, 轉化大腸桿菌感受態細胞(DH5α), 挑取陽性克隆測序。利用DNA StarSeqMan軟件對獲得的基因各片段進行拼接, NCBI Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast. cgi)對所得序列進行分析, SignalP4.1 (http://www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行信號肽的預測, 在線進行糖基化位點預測(http://www.cbs.dtu.dk/ services/ NetNGlyc/), 應用ClustalX 對推導的氨基酸同其他脊椎動物進行比對, 利用DNAMAN 6.0 軟件進行氨基酸序列一致性分析, 利用Mega5 軟件以鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)構建系統發生樹, 自引導檢驗(Bootstrap)獲得系統分支的置信度(重復次數為1000)。

表1 本研究所用引物序列

1.4 實時熒光定量PCR

根據所得到達氏鱘cDNA序列, 設計定量引物RT-和RT-(表 1), 以 1 齡個體的不同組織(心、肝、脾、脂肪、性腺、肌肉、腎、腸、垂體、下丘腦、端腦、中腦、小腦和延腦)cDNA 為模板進行qRT-PCR反應, 按SYBR?Premix ExTM(Perfect Real Time)試劑盒說明書操作, 實驗重復 3 次, 以達氏鱘-為內參基因。擴增反應在 Bio-Rad CFX96TM Real Time System 儀上進行, 反應程序為 95℃預變性10min, 95℃變性 15s, 54℃退火15s, 72℃延伸15s, 共40個循環。

1.5 Western-blot分析

取達氏鱘各種組織加入適量蛋白勻漿緩沖液(100 mmol/L β-磷酸甘油, 20 mmol/L HEPES, 20 mmol/L EGTA, 15 mmol/L MgCl2, pH7.3, 臨用前加入1 mmol/L DTT, 2 mmol/L PMSF, 2.5 μg/mL leupetin, 2.5 μg/mL aprotinin), 冰浴勻漿, 離心取上清, 加入Loading Buffer沸水浴10min, 冷卻后經SDS-PAGE 蛋白電泳分離, 使用Mini Trans-Blot (Bio-Rad, 美國)電轉儀, 將蛋白轉至 PVDF 膜(80 V, 0.5h)。TBS溶液(0.1 mol/L NaCl, 0.1 mol/L Tris, pH 7.5)漂洗3次, 5%脫脂奶粉封閉(2h), 1︰500稀釋中華鱘GH抗體4℃孵育過夜; TBS漂洗3次后加入堿性磷酸酶標記的1︰5000稀釋的二抗, 室溫孵育1h, TBS漂洗后使用NBT/BCIP避光顯色, 選取達氏鱘Adβ-actin為內參蛋白, 實驗過程與GH相同, 一抗1︰10000稀釋, 二抗1︰1000稀釋。

1.6 熒光免疫組化及組織學觀察

達氏鱘腦組織樣品用4%多聚甲醛固定, 常規脫水透明處理, 石蠟包埋, 橫向連續切片, 厚度約為4 μm, 熒光免疫組化與HE染色選用鄰近切片。選取石蠟切片脫蠟后HE 染色, 光學顯微鏡觀察拍照。熒光免疫組化石蠟切片脫蠟后, PBS洗三次, 每次5min; 抗原修復液煮沸10min, 自然冷卻至室溫, PBS洗三次, 每次5min; 3%過氧化氫37℃下處理30min, PBS洗三次, 每次5min; 5%脫脂奶粉封閉1h, 添加一抗(1︰200)處理, “濕盒”過夜; PBST洗5次, 每次10min, PBS洗兩次, 每次10min; 以2%正常羊血清稀釋FITC標記的羊抗兔血清(1︰100), 在室溫條件下避光孵育1h; PBS洗5次, 每次10min, DAPI(1︰1000)染色30min; PBS洗5次, 每次10min, 最后用抗淬滅劑封片, 熒光顯微鏡下觀察、拍照。

2 結果

2.1 達氏鱘全長cDNA及推導的氨基酸序列

分別以3尾達氏鱘垂體SMART cDNA為模板, 擴增出的達氏鱘cDNA全長序列完全一致, 利用Blast軟件與GenBank中已知的序列進行同源性比較, 結果證實所得序列為的cDNA。cDNA序列全長1008 bp, 包含52 bp的5′UTR和311 bp的3′UTR, 其開放閱讀框ORF為645 bp, 編碼214個氨基酸, 相對分子質量約為24 kD。根據SignalP4.1預測, 其多肽前24個氨基酸為信號肽, 成熟肽包含190個氨基酸, 在氨基酸序列中存在一個潛在的N-糖基化位點(Asn-Cys-Ser)和4個半胱氨酸Cys殘基, 形成2個二硫鍵(GenBank登錄號: KJ650095)。

2.2 達氏鱘GH氨基酸序列一致性分析及系統進化樹的構建

將推導的達氏鱘GH氨基酸序列與其他代表性脊椎動物相應序列進行多重比對, 結果表明, 達氏鱘與其他幾種鱘形目魚類的GH氨基酸序列一致性最高, 均達到95%以上。達氏鱘GH與兩棲類非洲爪蟾()、爬行類的棕樹蛇()、鳥類的雞()及哺乳類的人()和小鼠()相應序列一致性均超過50%, 而與幾種真骨魚類的一致性較低, 為40%—45%。運用Mega 5軟件構建了基于GH氨基酸序列的NJ系統發育樹(圖1), 結果表明, 以高等脊椎動物(兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳類)為外群, 可識別出2個單系類群: 7種鱘形目魚類聚為一類; 3種真骨魚類和1種軟骨魚類聚為一類。

2.3 達氏鱘mRNA的組織表達特征

選擇達氏鱘-作為內參基因, 采用real-time qPCR方法檢測了達氏鱘mRNA在達氏鱘垂體、下丘腦、心、肝等不同組織中的表達情況, 熔解曲線顯示為單一峰值, 表明無非特異性擴增和引物二聚體。結果發現,mRNA僅在垂體和下丘腦中表達, 垂體GH表達量約為下丘腦中的110倍, 而在其他檢測的組織中無表達(圖2)。

2.4 達氏鱘GH蛋白的組織表達

采用Western-blot方法檢測了達氏鱘GH蛋白在垂體、下丘腦、心、肝等不同組織中的表達情況。與mRNA的組織分布一致, GH蛋白僅在垂體和下丘腦中表達, 且垂體中GH蛋白的表達量明顯高于下丘腦(圖3)。

A. 達氏鱘腦組切片位置示意圖; B. 垂體及下丘腦熒光免疫組化圖片, B1和B2分別為下丘和垂體部分區域放大, GH抗體利用FITC綠色熒光標記, 藍色熒光DAPI標記細胞核; C. 下丘腦及垂體組織HE染色, C1為局部區域放大圖、C2和C3分別為下丘腦和垂體部分區域放大, 圖中強嗜酸性細胞(胞質紅色)為生長激素分泌細胞; Pi. 垂體; Hy. 下丘腦; 圖中標尺單位為μm

Schematic drawing of a sagittal section of the brain ofshowing the location of the transverse section (A); Immunofluorescence signals stained with anti-Growth Hormone (GH) antiserum, showing GH immunoreactive cells in the pituitary and hypothalamus (B). The pituitary and hypothalamus stained with Harris’s hematoxylin and eosin (C); Pi. pituitary; Hy. Hypothalamus; Bar μm

2.5 達氏鱘GH分泌細胞的定位

將達氏鱘腦組織整體固定后, 橫向連續切片, 切片位置如示意圖4A所示, 熒光免疫組化及HE染色試驗選用臨近切片。熒光免疫組化顯示, 達氏鱘下丘腦(圖4B、4B1)和垂體(圖4B、4B2)中存在對GH抗體強烈的特異性免疫反應, 信號明顯, 下丘腦及垂體中具有特異性信號的細胞形態一致。與垂體中(圖4B2)信號細胞排列比較密集相比, 下丘腦中(圖4B1)信號細胞分布比較分散且數量較少。HE染色輔助定位生長激素分泌細胞(圖4C、4C1、4C2、4C3), 生長激素分泌細胞含有致密的嗜酸性細胞質, 易被伊紅著色, 在垂體(圖4C3)和下丘腦內(圖4C2)分布著強嗜酸性細胞, 區域位置與熒光免疫組化中的特異性信號細胞一致, 可以確定為生長激素分泌細胞。

3 討論

本研究從達氏鱘垂體中擴增獲得達氏鱘的全長cDNA序列, 該序列編碼214個氨基酸, 與其他已報道的幾種鱘魚GH序列一致。對不同脊椎動物GH蛋白氨基酸序列進行比對發現, 從低等的魚類至高等的哺乳類, Cys殘基的數目和位置都是一致的, 可形成2個二硫鍵, 這對GH蛋白的正確折疊、特定空間結構維持及生物學活性的實現起重要作用。在達氏鱘GH氨基酸序列中發現一個潛在的N-糖基化位點, 值得關注的是在所有參與序列分析的鱘形目魚類、軟骨魚類、真骨魚類、甚至還有兩棲類的非洲爪蟾及鳥類的雞中相同區域存在完全一樣的潛在糖基化位點“NCT”, 符合經典的三聯子N-糖基化序列Asn-X-Thr/Ser; 而在哺乳類的人、鼠及爬行類的棕樹蛇中, 沒有符合經典N-糖基化的序列。三種真骨魚類除“NCT”外, 還存在“NDS”這一潛在的糖基化位點, 糖基化位點在蛋白分泌到細胞表面的過程中起到信號的作用, 是生物體內最為重要的蛋白質翻譯后修飾形式之一[25, 26], 不同物種間的差別可能是由于進化或功能分化造成的。

生長激素基因是一個相對保守的基因, 其序列結構具有高度進化分類意義, 將達氏鱘GH的氨基酸序列與其他幾種脊椎動物比對分析顯示, 不同類群的一致性差異較大, 其中達氏鱘與生境部分重疊的中華鱘氨基酸序列的一致性高達98%, 與其他幾種鱘形目魚類相比一致性也在95%以上, 表明GH在鱘形目魚類中高度保守。值得關注的是達氏鱘GH氨基酸序列同兩棲類的非洲爪蟾、爬行類的棕樹蛇、鳥類的雞、哺乳類的人和鼠的一致性要高于幾種真骨魚類, 這與在中華鱘[14]、歐洲鰉和俄羅斯鱘[15]、波斯鱘[16]中的研究類似, 表明了達氏鱘作為一種比較原始的魚類, 在遺傳上與四足類脊椎動物的親緣關系要近于真骨魚類。將達氏鱘與其他幾種鱘形目魚類、真骨魚類、軟骨魚類和兩棲類、爬行類、鳥類、哺乳動物進行了同源性聚類分析,能得到同樣的結論, 達氏鱘作為硬骨魚類家族中古老的物種, 研究其進化過程具有重要意義。

魚類生長受到遺傳、營養和內分泌等多種因素的調控, 而遺傳及營養因素主要是通過內分泌途徑影響生長。目前已知調控魚類生長的內分泌軸主要為下丘腦-垂體-肝臟生長調控軸, 垂體處于魚類生長內分泌調控系統的核心位置, 垂體分泌的生長激素通過血液循環運送到肝臟及其他靶器官, 靶器官受到刺激后胰島素樣生長因子(IGF-I)得以表達, 進而發揮生物學功能。除垂體外, 在包括魚類在內的脊椎動物中還發現有垂體外組織存在GH的表達[27—30], 生長激素在神經系統、免疫系統、生殖系統、消化系統、呼吸系統內, 在皮膚里、在骨骼中甚至在心血管系統內都能檢測到它的表達, 它的功能和作用不僅僅是靠內分泌的方式所體現, 還能夠通過自分泌或旁分泌的方式發揮生理功能。本研究利用real-time qPCR和western-blot技術從mRNA和蛋白質水平來了解生長激素在達氏鱘組織中的表達特征, 結果表明mRNA及蛋白在垂體和下丘腦中表達。下丘腦在空間距離和功能作用上與垂體聯系緊密。在對小鼠的研究中也發現生長激素在下丘腦中存在表達, 可能參與了對腦的功能的調控[26]。在本研究中除下丘腦和垂體外并未在其他組織中檢測到mRNA和蛋白的表達, 而GH在不同組織中的表達和性別、年齡及生長發育情況都有一定關系。本研究試驗魚為1齡幼魚, 可能存在幼魚期垂體中GH的合成和分泌非常旺盛, 通過GH-IGFI軸刺激肝臟合成的IGF水平比較高, 從而抑制了垂體外各組織中GH的表達, 不同年齡、性別和生長發育情況達氏鱘GH表達特征還有待于進一步研究。

垂體是魚類重要的內分泌腺體, 參與魚類生長、發育、生殖和滲透壓等各種生命活動的調控。GH、促性腺激素(GtH)、促甲狀腺激素(TSH)、促腎上腺皮質激素(ACTH)、催乳激素(PRL)、生長催乳素(SL)和黑色素細胞刺激激素(MSH)共同組成了魚體的腺垂體激素, 它們由不同的分泌細胞分泌, 其分布特征在不同種魚間是相似的[31—33]。針對幾種分泌激素的腺垂體細胞的研究手段主要有常規染色、免疫組織化學及免疫熒光標記等方法, 本研究利用中華鱘GH抗體進行熒光免疫組織化學研究, 生長激素抗原能夠特異性的識別抗體而得以定位, 常規HE染色輔助定位生長激素分泌細胞, HE染色生長激素分泌細胞呈強嗜酸性, 兩種定位方式選擇相近切片, 細胞區域位置一致, 形態一致, 共同定位了垂體和下丘腦中的生長激素分泌細胞(圖4), 得出的結果與其他研究一致[31—33]。

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SHAN Xi-Shuang1, 2, YUE Hua-Mei1, CHEN Xi-Hua1, YE Huan1, YANG Xiao-Ge1and LI Chuang-Ju1

(1. Key Laboratory of Freshwater Biodiversity Conservation, Ministry of Agriculture of China, Yangtze River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuhan 430223, China; 2.College of Fisheries and Life, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The Dabry’s sturgeon (Dumeril, 1868) mainly distributes in the upper Yangtze River of China. It is currently endangered due to the destruction of their spawning grounds and other anthropogenic interferences. In this study, the full-length cDNA sequence ofwas cloned from SMART cDNAs of pituitary in. The Dabry’s sturgeoncDNA was 1008 bp in length, including a 52 bp 5′-untranslated region (UTR), a 311 bp 3′ UTR and a 645 bp open reading frame (ORF) encoding a peptide of 143 amino acids. Amino acid sequence alignment revealed thatGH shared extremely high identities (over 95%) with its counterparts in other sturgeons. Moreover, sturgeons showed lower GH sequence identities with other bony fish than that of Amphibia, Reptilia, Aves, and Mammalia. By quantitative real-time PCR,mRNAs were detected in the pituitary and hypothalamus but absent in any of other somatic organs examined. Moreover, the expression ofmRNAs in the pituitary was about 110 times to that of hypothalamus. Western-blot analysis suggested the GH expression in both the pituitary and hypothalamus, with higher expression level in the pituitary, which is consistent with the result of qRT-PCR. Immuno?uoresence locali-zation showed strong GH-positive signals in the pars intermedia of the pituitary, together with weak fluorescence signals detected in the hypothalamus. HE staining indicated that GH was mainly secreted by eosinophilic cells in the adenohypophysis. This study will benefit both the evolution study of vertebrategenes and the further biological function study of GH in cultured.

; Growth hormone; qRT-PCR; Western-blot; Immunolocalization

10.7541/2015.41

Q344+.1

A

1000-3207(2015)02-0307-08

2014-04-25;

2014-09-22

國家高技術研究發展計劃項目課題一(2011AA100401); 中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金項目(2013JBFZ01); 國家自然科學基金青年科學基金項目(31001104)資助

單喜雙(1989—), 男, 吉林扶余人; 碩士研究生; 主要研究方向為魚類分子遺傳。E-mail: s9shanxishuang@126.com

李創舉, 博士, 副研究員, 碩士研究生導師; E-mail: lcj@yfi.ac.cn