基于焦磷酸測序技術的基因突變檢測在精準醫療中的應用研究進展

李靖軒，金益如，徐吟秋，宋沁馨*，周國華

（1. 中國藥科大學藥物質量與安全預警教育部重點實驗室，江蘇 南京210009；2. 中國藥科大學藥物分析教研室，江蘇 南京210009；3. 南京軍區南京總醫院藥理科，江蘇 南京210002）

基于焦磷酸測序技術的基因突變檢測在精準醫療中的應用研究進展

李靖軒1，2，金益如1，2，徐吟秋1，2，宋沁馨1，2*，周國華3

（1. 中國藥科大學藥物質量與安全預警教育部重點實驗室，江蘇 南京210009；2. 中國藥科大學藥物分析教研室，江蘇 南京210009；3. 南京軍區南京總醫院藥理科，江蘇 南京210002）

基因突變檢測在腫瘤等疾病的早期診斷、個體化給藥指導、疾病治療進程與耐藥監控等方面具有極其重要的意義。隨著測序技術的不斷發展，DNA突變的檢測與分析已為病毒感染、血液病和實體瘤等疾病的個體化診治提供重要參考。焦磷酸測序技術是一種基于生物發光法測定焦磷酸鹽的實時DNA測序技術，其用于DNA序列分析時不需電泳和熒光標記，定量性能好，結果準確，易于實現自動化，在基因突變檢測分析與腫瘤等疾病診治中發揮巨大作用。綜述基于焦磷酸測序技術的基因突變檢測在分子靶向個體化治療和疾病診斷中的應用研究進展。

焦磷酸測序；基因突變；個體化治療；疾病診斷

基因突變在腫瘤等其他疾病的發生、發展以及治療過程中產生耐藥等進程中發揮重要作用，而腫瘤的特征之一就是人基因組的不穩定性和突變［1］。因此，基因突變的檢測在腫瘤早期診斷、指導個體化給藥、監控治療進程中耐藥發生等方面具有極其重要的意義［2］。隨著測序技術的不斷發展，在個體化腫瘤診治領域，DNA突變的檢測與分析已經為很多實體腫瘤和惡性血液病的個體化治療提供了重要參考。例如：在應用酪氨酸激酶抑制劑（TKI）治療非小細胞肺癌（NSCLC）以及抗表皮生長因子受體（EGFR）單抗治療結直腸癌（CRC）前，首先對 EGFR 和KRAS 基因的突變情況進行檢測分析［3］；此外，乳頭狀甲狀腺癌和轉移性惡性黑色素瘤 BRAF 基因V600E突變靶向藥物維羅非尼（vemurafenib）在用于腫瘤的診治過程中，均需通過

基因測序來檢測患者BRAF 基因V600E突變狀況，從而判斷藥物適用與否。

焦磷酸測序（pyrosequencing）技術（Ronaghi等，Science， 1998年）是基于單個堿基逐個延伸反應的原理，可以克服Sanger測序法（雙脫氧核苷酸鏈終止法）的缺點，是Sanger測序法的重要補充。其原理是：引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶（luciferase）和三磷酸腺苷雙磷酸酶等4種酶的協同作用下，引物上每一個脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯起來，通過檢測熒光的釋放和強度，達到實時測定DNA序列的目的。采用該技術進行DNA序列分析時，不需電泳或熒光標記，可以直接測定引物后面的堿基序列，定量性能好，結果準確，適合對大樣本進行快速檢測，易于實現自動化。因此，焦磷酸測序技術在基因突變檢測分析與腫瘤診斷和治療中可發揮巨大作用。

1 基于焦磷酸測序技術的基因突變檢測在分子靶向個體化治療中的應用研究

1.1 指導肺癌靶向治療的基因突變檢測

肺癌是世界上發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，而NSCLC約占肺癌病例的80%～85%，其1/3患者在初次確診時已經處于局部晚期，錯過手術的最佳時機，中位數生存期僅4～5個月［4］。以手術、化療和放療為主的傳統治療方法如今已經進入一個瓶頸期，而分子靶向治療正逐漸成為晚期NSCLC的重要治療手段。以表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）為代表的分子靶向治療可延長NSCLC患者的生存期，但是EGFR-TKI的療效與EGFR或KRAS基因突變密切相關：EGFR基因18、19、21號外顯子突變是EGFRTKI的敏感指標，而EGFR基因20號外顯子T790M突變和KRAS基因突變則是EGFR-TKI的耐藥指標［5］。因此，在接受EGFR-TKI治療前進行EGFR/KRAS基因檢測對指導靶向治療非常重要。

Tsiatis等［6］應用Sanger測序法、焦磷酸測序法和高分辨率熔解曲線（HRM）法對180例甲醛溶液固定樣本和石蠟包埋樣本（其中，58例未轉移CRC，42例轉移性結直腸癌，63例未轉移和17例轉移性肺腺癌）和20個正常結腸樣本的KRAS基因12、13號密碼子的突變進行檢測，結果發現，180例癌癥樣本中62.2%的KRAS基因發生突變，37. 8%未發生突變。其中，HRM法檢測時，有10%的樣本并不能給出明確的結論，但并未發生陽性或陰性的檢測錯誤；焦磷酸測序法檢測時，也未發生陽性或陰性檢測錯誤；Sanger測序法檢測時，有11.1%的陽性和6. 1%的陰性檢測錯誤。此外，該研究發現，Sanger測序法、焦磷酸測序法和HRM法的檢測靈敏度分別約為15%～20% 、5%和10%的等位基因突變。

Kim等［7］應用焦磷酸測序技術檢測202例肺癌患者的石蠟包埋樣本EGFR基因18～21號外顯子突變，結果顯示，樣本EGFR基因突變率為26.7%（54/202），其中女性（與男性相比，52.1% vs 13.0%）、不抽煙者（與抽煙者相比，47.8 % vs 15.8%）、腺癌（與非腺癌相比，35.2% vs 5.2%）樣本中活性EGFR基因突變更為常見；EGFR基因突變與對EGFR-TKI藥物的反應密切相關，具有EGFR基因活性突變和野生型的患者對藥物敏感性分別為82.4%和5.9%；而且在臨床治療過程中，女性、不吸煙和腺癌的患者其療效均好于男性、吸煙和非腺癌的患者。此研究表明，EGFR基因突變與良好的臨床參數指標（女性、不吸煙、腺癌等）在預測疾病治療效果的時候有良好的一致性和相關性；焦磷酸測序技術不僅可以檢測石蠟包埋組織中的基因突變，還能很好地預測臨床上患者對EGFR-TKI治療的響應?？梢?，焦磷酸測序技術是一個靈敏、快速、簡單的基因測序平臺。

Ulivi等［8］在探索基因突變檢測的最優樣本來源時，應用直接測序法和焦磷酸測序法檢測疑似NSCLC患者新鮮和固定后的縱膈淋巴結及附近組織中EGFR和KRAS基因突變，并將結果進行對比。32名患者（25名為腺癌，7名為鱗狀細胞癌）的EGFR基因突變檢測結果：新鮮組織中2例陽性，固定后組織中3例陽性；KRAS基因突變檢測結果：新鮮組織中8例陽性，固定后組織中9例陽性。該研究表明，相較于新鮮組織，固定和染色后的樣本更易于分子檢測，究其原因，可能是新鮮組織中大量非腫瘤細胞的存在影響了檢測結果。

NSCLC分子靶點EGFR或KRAS的基因檢測大多需要腫瘤組織樣本。然而，臨床上經常遇到無法獲得腫瘤組織樣本的情況，使得EGFR或KRAS基因檢測難以開展，限制了NSCLC患者的分子靶向治療選擇。因此，探索組織樣本的良好替代物及檢測方法至關重要。

Akca等［9］應用焦磷酸測序技術檢測52例NSCLC患者循環腫瘤細胞DNA樣本的EGFR基因突變，其間，經焦磷酸測序技術檢測的所有血清DNA突變樣本，均用Sanger測序法驗證，并用同一患者的石蠟包埋組織進行驗證。結果，從血清DNA中檢測到21例（40.4%）樣本存在EGFR基因突變，其中，14例為E746-A750缺失，2例為E747-A750缺失，5例為L858R突變；石蠟包埋組織檢測到25例（48.1%）樣本存在EGFR突變，其中，17例為E746-A750缺失，2例為E747-A750缺失，6例為L858R突變；Sanger測序法檢測到21例（40.4%）樣本存在EGFR突變，其中，14例為E746-A750缺失，2例為E747-A750缺失，5例為L858R突變。此外，還發現，腺癌患者的EGFR基因突變率（24/36， 66.7%）比鱗狀細胞癌患者（1/16， 6.3%）更高。該研究表明，焦磷酸測序技術可有效用于檢測早期NSCLC患者血清DNA的EGFR突變，且在檢測EGFR突變時，焦磷酸測序技術較Sanger測序法更靈敏，其靈敏度足以實現對血清中DNA和石蠟包埋組織中DNA的檢測。

孫潔等［10］收集了63例晚期NSCLC患者的外周血標本，分離血漿并提取DNA，采用巢式PCR結合焦磷酸測序技術檢測KRAS基因12和13號密碼子的突變。結果顯示，63例NSCLC患者中，3例（4.76%）KRAS基因突變陽性，其中，2例是12號密碼子突變，1例是13號密碼子突變；患者血漿KRAS突變率均較低，與文獻報道的亞裔組織KRAS突變率一致，低于西方人的KRAS突變率。

1.2 指導結直腸癌靶向治療的基因突變檢測

CRC是常見的消化系統惡性腫瘤，而KRAS基因突變在CRC形成過程中起重要作用。近年來的研究表明，KRAS基因突變狀況與CRC預后密切關聯，是判斷CRC患者預后的重要指標［11］。而且，分子靶向藥物EGFR抑制劑西妥昔單抗（cetuximab）治療晚期CRC的效果與患者KRAS基因是否突變極為有關：KRAS基因野生型患者對西妥昔單抗敏感，而KRAS基因突變型患者對其不敏感。因此，KRAS基因是否突變可以作為西妥昔單抗的用藥判斷標準［12］。于是，快速、準確、靈敏地檢測KRAS基因突變狀況，有助于臨床上合理、精準制定CRC治療方案。

王樹新等［13］欲探索不同的方法檢測CRC組織中KRAS基因點突變的差異，分別采用焦磷酸測序法和雙脫氧測序法檢測60例CRC患者石蠟包埋組織樣本中KRAS基因的第12和14號密碼子，并對檢測結果進行對比分析。結果顯示，兩種方法均能夠檢測到KRAS基因突變，但是靈敏度各有不同：兩種方法對5例樣本的檢測結果不一致；焦磷酸測序法和雙脫氧測序法分別檢測出20例（33.3%）和15例（25%）KRAS基因突變，前者檢出率高于后者。對腫瘤細胞的病理分析發現，5例雙脫氧測序法漏檢的樣本中均有較多的炎癥細胞，腫瘤細胞則較少，不足20%，這可能是造成雙脫氧測序法漏檢的原因。該研究表明，在檢測KRAS基因突變的過程中，樣本中腫瘤細胞所占比例是影響檢測結果的關鍵因素；焦磷酸測序技術比雙脫氧測序法更靈敏，可以同時進行96個測序反應，不必對PCR產物進行特殊的純化處理，整個測序過程時間短，靈敏度可達5%。

黃新等［14］應用焦磷酸測序法檢測116例Ⅳ期原發性和11例轉移性CRC病灶中KRAS基因第12和13號密碼子上的點突變，結果，116例Ⅳ期原發性CRC樣本中，有29例檢出KRAS基因點突變陽性，突變率為25%，其中，24例（82.8%）為12號密碼子點突變，5例（17.2%）為13號密碼子點突變?？梢?，29例突變樣本第12號密碼子突變頻率高于第13號密碼子，且均為錯義突變，與以往的報道一致［15］。此外，該研究中，116例Ⅳ期CRC KRAS基因突變頻率與文獻報道亞洲人CRC基因突變率（17%～28%）大致相同，且未發現進展期CRC的突變情況與早期CRC有明顯差異；11例轉移病灶中的KRAS基因狀態與其原發病灶高度一致，說明KRAS基因突變在CRC早期形成過程中便已發生，因此，在對轉移性CRC患者進行KRAS基因檢測時，無論選擇原發灶還是轉移灶進行檢測，都是合理的，而患者KRAS基因的狀態可以指導對分子靶向藥物（如西妥昔單抗）的選擇。

王璇等［16］采用焦磷酸測序法檢測67例CRC患者石蠟包埋樣本的KRAS基因突變狀況，結果，檢測出26例（38.8%）KRAS基因突變樣本，其突變大多發生在第12號密碼子。該研究小組在分析突變類型和臨床參數之間的關系后發現，女性患者的KRAS基因突變率（57.7%）明顯高于男性患者（26.8%）；有淋巴結轉移的患者其KRAS基因突變率（58.8%）高于無淋巴結轉移者（32.0%）；而KRAS基因突變與患者的年齡、腫瘤所在部位、腫瘤浸潤深度、組織學類型和腫瘤分

期均無顯著相關性。提示，焦磷酸測序技術可以用于快速檢測KRAS基因突變，且KRAS基因突變在女性CRC患者和淋巴轉移的患者中更為多見。這些結論均可作為臨床上判斷CRC患者預后的重要參數。

de Macêdo等［17］研究了KRAS基因突變與CRC病人病理變化和臨床具體參數等信息的相關性，其間，通過偶聯巢式PCR優化了焦磷酸測序法，用于檢測KRAS基因突變，無需重復提取DNA和PCR擴增，成功率接近100%。該研究團隊利用巢式PCR偶聯焦磷酸測序技術對421例未經選擇的CRC患者的KRAS基因進行檢測，檢測對象均為石蠟包埋的組織。檢測結果顯示，421名患者中，KRAS基因突變率達33%，其中12號密碼子突變占76%，13號密碼子突變占24%。且該研究團隊在比較KRAS基因突變與臨床參數之間的關系時發現，腫瘤組織右側的突變大于且左側的突變，這與神經侵襲相關?？梢?，將巢式PCR和焦磷酸測序技術融合，可獲得高確定性檢測結果，能用于常規化驗的輔助測試。

Kosmidou等［18］應用焦磷酸測序法和Sanger測序法檢測171例CRC腺癌患者的KRAS、BRAF、PIK3CA基因突變情況，結果發現，在同一個腫瘤中，BRAF基因突變經常與KRAS基因突變成負相關，說明這兩個基因在腫瘤的形成和發展中所起的作用是相互影響的。而且，焦磷酸測序法檢測結果顯示，171例患者組織樣本中，92例（53.8%）的KRAS基因12或13號外顯子上有突變，并有2.3%的BARF基因突變及3.5%的PIK3CA基因突變；共檢測出的126個突變，其中57.9%是c.38G→A突變，22.2%是c.35G→T突變；50.7%的樣本存在腫瘤組織中心和外周的基因突變率不同的現象，且年齡、性別、淋巴結是否轉移、腫瘤的位置等差異也會導致突變頻率不同。此外，從檢測結果中能夠看出明顯的腫瘤異質性，即同一腫瘤組織的不同位置基因突變率不同，這些都可能影響腫瘤分子診斷檢測和個體化治療的效果。并且，焦磷酸測序法檢測出的突變樣本中有9個突變樣本Sanger測序法無法檢出，表明焦磷酸測序技術在檢測KRAS基因突變時比Sanger測序技術更靈敏，能檢測到3%～5%的突變。

Dobre等［19］利用焦磷酸測序技術檢測250例CRC患者KRAS基因12、13、61號外顯子的突變情況，并隨機選擇100例患者用PCR-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）法進行對比。結果，焦磷酸測序技術檢測的250例患者中，KRAS基因突變率為46.4%，大部分突變發生在12號外顯子上，小部分在61號外顯子上；在對照組的100例樣本中，PCR-RFLP法檢測到48例突變，而焦磷酸測序技術檢測到49例突變，且PCRRFLP法檢測到的突變均可以用焦磷酸測序技術進行驗證。該研究表明，這兩種檢測方法的靈敏度足以用于對CRC患者進行分子診斷，以建立適當的治療方式。而且，該研究小組建議，檢測大的腫瘤樣本時，使用PCR-RFLP法，因為這樣的樣本DNA濃度較高，且PCR-RFLP法相對便宜，而檢測小的腫瘤樣本組織（如穿刺樣本）時，應選用焦磷酸測序法，因為這時癌細胞濃度小，此法較為靈敏。

Altimari等［20］比較了Sanger測序法、ARMSScorpion法、焦磷酸測序法和雜交芯片法檢測60例CRC樣本中KRAS基因12和13號密碼子突變的靈敏性、特異性和準確性，結果，檢測發現，60例樣本中有20例KRAS基因為野生型；Sanger測序法、ARMSScorpion法、焦磷酸測序法和雜交芯片法的特異性均為100%，靈敏度分別為85%、90%、93%和92%，準確度分別為90%、93%、95%和95%；Sanger測序法的局限性在于其分析靈敏度較低，低于其他3種方法。該研究團隊還比較了目前經常使用的幾種基因突變檢測方法，結果表明，在診斷CRC KRAS基因突變時，焦磷酸測序法是一個較為合適的方法。

2 基于焦磷酸測序技術的基因突變檢測在疾病診斷中的應用研究

2.1 用于線粒體疾病診斷的基因突變檢測

人線粒體DNA是一個環狀DNA分子，用于編碼一些蛋白質翻譯時所需的氧化磷酸酶。線粒體DNA 3243位A→G的突變可以導致母體遺傳性糖尿病和耳聾，即線粒體糖尿病，又稱母系遺傳糖尿病伴耳聾綜合征。然而，常用的Sanger測序法其靈敏度不足以檢測出這種突變。Yan等［21］應用焦磷酸測序技術定量檢測無血緣的83名線粒體糖尿病患者白細胞線粒體DNA中A3243G突變，同時為了驗證結果的準確性，用焦磷酸測序法、Sanger測序法和PCR-RFLP法分別對人工標準樣品進行檢測，并對比。結果表明，焦磷酸測

序法的檢測準確性高于其他方法，靈敏度達2%，而A3243G突變有可能成為線粒體糖尿病的發病預測標志。

線粒體轉移核糖核酸（mt-tRNA）突變是最常見的與人類疾病相關的線粒體突變的子類型（mtDNA）突變?；加卸嘞到y線粒體疾病的患者其特征是肌肉病變、脊髓運動失調、感音神經性聽力損失、白內障和認知障礙等，通常存在m.7539C→T突變。Lehmann等［22］應用焦磷酸測序法證實了mtDNA突變的異質性。

2.2 用于甲狀腺癌診斷的基因突變檢測

細針穿刺細胞學是用于區分良性和惡性甲狀腺結節的主要手段，然而約20%～40%的檢測結果是不確定的，需要輔助診斷測試來確認其結果。而RAS基因突變已經作為甲狀腺癌分型的標志物。Guerra等［23］對37例甲狀腺疾病患者（16例良性增生性結節，21例甲狀腺濾泡癌）進行NRAS和KRAS基因突變檢測，結果顯示，良性和惡性患者的RAS基因突變率分別為31%和62%，大多數樣本突變等位基因的比率小于50%。且該研究表明，焦磷酸測序技術可作為區分良性與惡性甲狀腺腫瘤的輔助手段，對于臨床上甲狀腺癌的診斷和治療，可發揮重要作用。

在韓國，通過評價BRAF V600E突變，可以診斷乳頭狀甲狀腺癌癥?，F已有很多方法可用來檢測BRAF V600E突變，如直接測序法、等位基因特異性聚合酶鏈反應（AS-PCR）、實時熒光定量PCR、焦磷酸測序技術等。直接測序法作為標準方法，但是需要PCR，需要染料純化，靈敏度低；AS-PCR簡單快速，但是需要電泳輔助，可能會導致污染，且電泳條帶很弱時很難讀取。Kang等［24］應用PNA-clamping PCR、實時熒光定量PCR和焦磷酸測序技術等3種方法檢測100例乳頭狀甲狀腺癌癥患者石蠟包埋組織的BRAF V600E突變，并探討此突變對患者疾病診斷和預后的影響。結果，PNA-clamping PCR、實時熒光定量PCR和焦磷酸測序技術的檢測陽性率分別為66%、70%和68%，特異性分別是0.5%、1%和1%；且發現，BRAF V600E突變與癌癥的進程和不良預后因子相關，約30%具有此突變的患者其突變低于6%。該研究表明，焦磷酸測序技術可與實時熒光PCR和PNA-clamping PCR一樣用于檢測BRAF V600F突變，并是一種可以快速、靈敏地檢測BRA V600E突變的方法，它的應用對于臨床上乳頭狀甲狀腺癌癥的診斷和預后評估、進而選用合適的治療方案具有重要意義。

2.3 用于白血病診斷的基因突變檢測

急性髓性白血?。╝cute myelocytic leukemia，AML）是由于髓系造血干細胞發生積累性的獲得性基因突變，進而造成細胞增殖、分化和凋亡途徑發生改變的一種惡性疾病。NRAS基因突變是AML病例最常檢測出的髓系來源異常之一，其突變會產生一個具有穩定活性的NRAS蛋白，此蛋白不受細胞增殖和凋亡的控制，目前已發現NRAS基因突變與AML有關。Jeong等［25］檢測分析了成人AML患者的NRAS基因突變，并將焦磷酸測序技術和直接測序法對NRAS基因突變的檢測結果進行對比，其間共檢測分析了來自于83名成人AML患者的90個骨髓樣本的NRAS基因12、13和61號密碼子突變情況。結果，突變檢出率達7.2%，并發現，具有NRAS基因突變的患者其血紅蛋白水平和FLT3突變發生率均明顯較高，其中，3例突變發生在12號外顯子，2例突變發生在13號外顯子，1例突變發生在61號外顯子，但所有突變在治療期間都消失了；此外，用焦磷酸測序方法進行檢測后，再用直接測序法進行確證，發現兩者數據基本一致。提示，NRAS基因突變和治療反應、疾病進程有明顯相關性，說明其在臨床上的重要性，而焦磷酸測序技術能夠實現對基因突變的簡單、快速、高通量檢測，且無需電泳輔助，所提供的定量數據對于監測與診斷病情發展及治療情況具有重要意義。

Gebauer等［26］應用焦磷酸測序技術檢測14位華氏巨球蛋白血癥患者和10位多發性骨髓瘤患者的MYD88基因突變情況時發現，有78.6%（11/14）的華氏巨球蛋白血癥患者檢測出MYD88 p.L265P突變。為了驗證此檢測結果，該研究團隊用Sanger方法對照比較，結果表明，與其他方法相比，焦磷酸測序技術提供了一種快速、可靠、高靈敏、經濟實惠的用于檢測福爾馬林固定或者石蠟包埋組織中MYD88 p.L265P突變的方法；且由于此技術可以量化等位基因，所以其還可有效用于后續的疾病診斷與監測。

3 小結與展望

目前，基因突變檢測常采用的測序技術有Sanger測序法、焦磷酸測序技術、高通量測序技術等。Sanger

測序法廣泛應用于人類基因領域的科研工作，并獲得了以精確完成人類基因組序列檢測為代表的諸多成果［27］。該法以DNA單鏈為模板，在DNA聚合酶的作用下，模板特異性引物根據堿基互補配對原則將4種dNTP和經不同顏色染料標記的雙脫氧核糖核苷三磷酸（ddNTP）加到引物的3’-羥基末端，并使引物鏈得到延伸或使其延伸過程終止，得到各種連續長度的DNA片段；然后，經過電泳分離，應用激光誘發熒光法，可以檢測到各個片段末端的堿基種類。Sanger測序方法的優點在于，作為目前的金標準測序方法，可以檢測幾乎所有的基因突變。但其缺點是定量性能差，在檢測個別基因突變時，靈敏度不佳，耗時長，步驟多，費用高，工作量較大，適合大規模測序而不適合測定單堿基差異。此外，Sanger測序反應的信號強度直接與模板的量有關，如果突變的模板所占的比例很少，將直接作為背景噪音而很難檢測出來，因此，應用于基因突變檢測時，其最低檢測靈敏度為10%左右，而檢測低于10%的突變時，其檢測誤差極大。高通量測序法的檢測靈敏度則可高達1‰，但其檢測成本高，用時長，使其應用受到限制。焦磷酸測序技術是一項高通量、低成本、自動化程度高的測序技術，在檢測基因突變時，最低檢測靈敏度可達2%。此技術無須凝膠電泳輔助，無須對樣品進行特殊的標記和染色處理，省時省力，操作簡單，結果直觀易懂，檢測過程耗時短，非常適用于對大量樣本的快速檢測。目前，焦磷酸測序技術已經成為分析研究基因突變的重要手段，并廣泛應用于臨床多種疾病的診斷和治療過程中，在檢測基因突變時，具有Sanger測序法和高通量測序法無法比擬的獨特優勢，檢測靈敏度高于Sanger測序法，比高通量測序法成本低、耗時短。而且，焦磷酸測序技術還廣泛應用于遺傳分析學、SNP分型分析、分子診斷、細菌與病毒的分型分析、甲基化分析等。相信，隨著現代科技水平的不斷提高，焦磷酸測序技術也必將不斷進步、完善，并受到越來越多的關注。

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［專家介紹］ 宋沁馨：副教授，博士生導師。江蘇省藥學會藥物基因組委員會委員，江蘇省青藍工程培養對象。新西蘭奧克蘭大學、新西蘭維多利亞大學、日本日立中央研究所訪問學者，科技部中新科學家交流計劃成員。主持國家及省自然基金、省社會發展項目、國家重大專項子課題等十余項。獲教育部科技進步一等獎、江蘇省科技進步三等獎、云南省科技進步一等獎、南京市優秀論文獎等。發表論文50余篇，主編英文專著1部，副主編中文專著2部，參編著作9部。

Research Progress in Application of Gene Mutation Detection by Pyrosequencing Technique in Precision Medicine

LI Jingxuan1，2， JIN Yiru1，2， XU yinqiu1，2， SONG Qinxin1，2， ZHOU Guohua3
（1. Key Laboratory of Drug Quality Control and Pharmacovigilance of Ministry of Education， China Pharmaceutical University， Nanjing 210009，China； 2. Department of Pharmaceutical Analysis， China Pharmaceutical University， Nanjing 210009， China； 3. Department of Pharmacology，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command， Nanjing 210002， China）

Gene mutation detection has great significance in early diagnosis， individual medication guidance and monitoring of treatment response and drug resistance. With the continuous development of sequencing technology， DNA mutation detection has provided important

for individualized diagnosis and treatment of the diseases such as viral infections， blood diseases and solid tumors. Pyrosequencing is a real-time DNA sequencing technology based on pyrophosphate （PPi） detection by bioluminescent method without the need of electrophoresis and fluorescence labeling for DNA sequencing. It is characterized by high quantitative performance， accurate analysis and easy automation. Pyrosequencing provides a reliable method to detect gene mutation which is useful in disease diagnosis and treatment. The research progress in application of gene mutation detection by pyrosequencing technique in molecular targeting for individualized treatment and disease diagnosis was reviewed.

pyrosequencing； gene mutation； individualized treatment； disease diagnosis

Q523

A

1001-5094（2015）12-0889-07

接受日期：2015-11-04

項目資助：江蘇省基礎研究計劃（自然科學基金）項目（No. BK20151445）；中國博士后科學基金（No. 2012M512179，2013T60962）；中央高?；究蒲袠I務費重點項目（No. 2015ZD008）；藥物質量與安全預警教育部重點實驗室資助項目（No. DQCP2015MS02）；國家基礎科學人才培養基金項目（No. J1030830）；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目；江蘇省青藍工程項目

*通訊作者：宋沁馨，副教授，博士生導師；

研究方向：藥物基因組學，臨床藥物分析，分子診斷新技術；

Tel：025-80860196；E-mail: songqinxin@cpu.edu.cn