多拷貝基因座DYF399S1在河南漢族群體中的遺傳多態性分析*

張 晶，王 磊，黃艷梅#，馬亞磊，尚萬兵，張銀珂，郭 棟，黃書琴

1)新鄉醫學院法醫物證學教研室 新鄉453003 2)鄭州市公安局刑事科學技術研究所 鄭州450000

Y 染色體短串聯重復序列(Y chromosome short ta ndem repeat，Y-STR)遺傳標記具有分型簡單、易于擴增、重復性好、易于推廣、屬于男性特有、呈父系遺傳等特點［1-2］，能夠有效地反映人群分化、遷徙的信息［3］，目前仍然是法醫遺傳學研究的熱點，在法醫實踐中成為分析混合斑、微量、降解的生物檢材的個人識別和父系男性成員間親權鑒定的重要手段［4］。

DYF399S1 基因座是繼DYS385a/b、DYS389Ⅰ/Ⅱ、DYS459a/b、DYS464a/b/c/d 和DYS527a/b 等之后，在Y 染色體上發現的又一多拷貝基因座［5-7］，目前對于多拷貝Y-STR 基因座的研究較少，缺乏群體數據。作者對DYF399S1 在河南漢族248 名無關男性個體中的單體型分布和遺傳多態性進行了分析，為其在法醫學和人類學中的應用提供基礎資料。

1 材料與方法

1．1 群體樣本來源及模板DNA 的提取 248 名河南漢族無關男性個體均簽署知情同意書，其三代以內均在河南生活。采集血標本，采用酚-氯仿法提取基因組DNA。

1．2 DYF399S1 基因檢測 DYF399S1 基因座引物正向序列為5'FAM-GGGTTTTCACCAGTTTGCAT-3'，反向序列為5'-CCATGTTTTGGGACATTCCT-3'，由Invitrogen 生物有限公司-上海英駿生物技術有限公司合成。PCR 反應體系25 μL，包含1 ×Taq DNA 聚合酶緩沖液，200 μmol/L dNTPs，0．5 μmol/L 引物，30～50 ng 模板DNA，1 U Taq Plus DNA 聚合酶(Thermo scientific 賽默飛公司)。熱循環參數:預變性94℃3 min;94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸35 s，32個循環;產物于4℃保存。采用60 g/L 中性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR 產物，產物經電泳分離后送Invitrogen 生物有限公司-上海英駿生物技術有限公司測序。運用ABI 3130 基因自動分析儀和GeneMapper ID v3．5 軟件分析結果。

1．3 等位基因分型

1．3．1 標準物的制備 將各等位基因片段在60 g/L 中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，回收后分別放入500 μL EP 管中，加40 μL 0．5 ×TE 過夜，然后取3．0 μL作模板，按1．2 條件擴增。將擴增后的產物等比例混勻。

1．3．2 等位基因的命名 DYF399S1 在Y 染色體上有3個位置［8］，預期擴增后觀察到的片段有1～3個。參考E-型命名法，結合觀察到的片段大小和電泳時各片段的峰高比率進行等位基因命名［9］。根據觀察到的片段，若僅有1個峰或1 條帶，則讀取3個相同的等位基因;若有2 條深淺不同的帶或2個高度不同的峰，則帶深或峰高者讀取2個相同的等位基因，帶淺或峰低者讀取1個等位基因;若有3 條帶，則讀取3個不同的等位基因。

1．4 統計學處理 單體型多樣性(haplotype diversity，HD)=n(1 －∑χ2)/(n－1)，n 表示樣本數，x 為群體中每一種等位基因(或單體型)的頻率［10］。個體識別力(the discriminating power，DP)=1－∑Pi2［10］。單體型辨別能力(discrimination capacity，DC)=n/N，N 表示樣本數，n 表示僅出現1次的單體型的個數［8］。

2 結果

2．1 DYF399S1 基因座序列分析 DYF399S1 基因座是3 拷貝基因座，在Y 染色體上有3個不同的片段，分型圖譜見圖1，電泳結果見圖2。

圖1 DYF399S1 基因座分型圖譜

圖2 DYF399S1 基因座PAGE 電泳圖

2．2 DYF399S1 基因座基序分析 根據測序結果(圖3)，該基因座在河南漢族群體中基序表現為(GAAA)3N7(GAAA)12-22，其模塊結構包括1個變異的核心序列模塊和1個固定的重復序列，根據變異模塊結構中核心序列的重復次數進行等位基因的命名。在河南漢族群體248例無關男性個體中，共觀察到11個不同的等位基因，即核心序列重復數目變異在12～22(表1)，共有序列為aggtagaggg aggccaaaagcccaacaggaaaaaataaaa(gaaa)3aagaaaa(gaaa)11-23gaacttttacccttttgacagcatatgagacttctgggttcttttctcctgggtccaat cctaagctgtccagtttaatgtttgggaaattaactcttccaaacttggaggatgca ttgaag。下劃線為引物序列，括號內為DYF399S1 基因座的核心序列。

圖3 DYF399S1 基因座重復序列測序結果(正向)

表1 DYF399S1 基因座等位基因及基序

2．3 DYF399S1 等位基因及頻率 11個等位基因的名稱與頻率見表2。單體型分布見表3。由表3可以看出，3個拷貝組成的單體型有94種，出現最多的單體型是18/18/18，頻率是0．080 6;僅出現1次的單體型有49種，頻率是0．004 0。HD 和DP 分別為0．865 5 和0．862 1，DC 為0．372 5。

表2 DYF399S1 基因座等位基因的分布

表3 DYF399S1 基因座單體型的分布

續表3

3 討論

DYF399S1 是目前發現的惟一的3 拷貝Y-STR基因座［11］，相當于3個位點，將基因座命名為DYF399S1a/b/c。作者在河南漢族群體中觀察到其基序為(GAAA)3N7(GAAA)n，與Henson 等［11］報道的一致;但是與Henson 等［11］報道的14～21 及1個變異等位基因20．1 不同，作者在248 名河南漢族個體中觀察到的等位基因是12～22，未發現變異的等位基因。

DYF399S1 基因座和DYS464 基因座都是已知的快速突變基因座，它們對于有關男性個體的鑒別有重要意義［12-13］。作者用PCR 法檢測了248 名河南漢族無關男性個體，共發現11個不同長度的片段，它們具有相同的模塊結構，由于還無法將其各個拷貝準確定位，因此推測DYF399S1 或許隱藏著更高的多態性［14］。

在248 名河南漢族無關男性個體中，DYF399S1基因座組成的單體型有94種，DC 為0．372 5，HD和DP 分別為0．865 5 和0．862 1。說明多拷貝YSTR 基因組DYF399S1 具有高度多態性，在法醫學實踐和人類進化研究中具有很好的應用前景。

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