草銨膦在甘蔗愈傷分化階段和剛成苗階段篩選濃度的確定

何慧怡，樊麗娜，齊永文，勞方業，鄧海華

(廣州甘蔗糖業研究所 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室，廣東廣州 510316)

草銨膦在甘蔗愈傷分化階段和剛成苗階段篩選濃度的確定

何慧怡，樊麗娜，齊永文*，勞方業，鄧海華

(廣州甘蔗糖業研究所 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室，廣東廣州 510316)

本試驗以甘蔗品種ROC22和粵糖93-159的愈傷組織和剛分化4周小苗為試驗材料，初步確定了草銨膦在愈傷組織分化階段和剛分化4周小苗階段的篩選濃度。綜合試驗結果，適合草銨膦在ROC22和粵糖93-159愈傷組織分化階段的篩選濃度為2.5 μmol/L；適合草銨膦對ROC22剛分化4周小苗的篩選濃度為5.5 μmol/L，適合草銨膦對粵糖93-159剛分化4周小苗的篩選濃度為6.6 μmol/L。

草銨膦；甘蔗；篩選濃度

0 引言

甘蔗是重要的糖料作物，也是制糖工業的重要支柱[1]。采用化學除草劑防治蔗園雜草來代替人工及機械除草，是一項已在世界上廣泛應用的技術。它具有防治成本低、節省工時、減輕勞動強度、能及時有效地防除雜草、保證蔗株正常生長而獲高產的優點[2-3]。但化學除草劑若使用不當，則會造成藥害，使甘蔗不能正常生長而導致減產。因此生產上對具有抗除草劑抗性的甘蔗品種需求越來越大。

草銨膦(Glufosinate-Ammonium)是德國赫斯特

公司創制的有機磷類非傳導滅生性除草劑，具有活性高、低毒、環境兼容性好等特點。目前，對草銨膦具有抗性的作物基本上都是通過轉基因的方法獲得的[4-6]。在甘蔗育種方面，與其他作物相似，Bar基因常被作為目的基因的選擇標記而轉入甘蔗體內，從而使得這些轉基因甘蔗具有目的性狀的同時也具有對草銨膦的抗性[7-10]。近年來除了轉基因育種外，還出現了誘變育種等新育種方法[11-13]，通過新育種方法選育具除草劑抗性的甘蔗品種可以縮短育種年限，提高育種效率。因此確定草銨膦在甘蔗組培階段的篩選濃度，對轉基因育種及誘變育種等后期抗性篩選階段有積極意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘蔗品種ROC22和粵糖93-159的愈傷組織以及這兩品種剛分化4周的小苗。

1.2 試驗方法

1.2.1 草銨膦在愈傷組織分化階段篩選濃度的確定

把ROC22和粵糖93-159的愈傷組織接入含有草銨膦0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 μmol/L的愈傷誘導培養基里，對照組不加草銨膦。4周后調查愈傷組織的轉綠率和愈傷成苗率情況。轉綠率為長出綠點或分化出小苗的愈傷組織的塊數與接種的愈傷組織總塊數的百分比。愈傷成苗率為分化出小苗的愈傷組織塊數與接種的愈傷組織總塊數的百分比。

1.2.2 草銨膦在剛分化4周小苗階段篩選濃度的確定

把ROC22和粵糖93-159剛分化4周的小苗接入含有草銨膦1.0、2.5、4.0、5.0和7.5 μmol/L的小苗增殖培養基里，對照組不加草銨膦。4周后調查草銨膦對分化小苗的的致死率和苗的生長情況。

2 結果與分析

2.1 愈傷組織在不同濃度草銨膦中的轉綠率

ROC22和粵糖93-159的愈傷組織在不同濃度草銨膦中培養4周后的轉綠率見圖1和圖2。從圖1和圖2可以看出，2個基因型甘蔗的愈傷組織轉綠率都隨著草銨膦濃度的升高而下降，粵糖93-159愈傷組織分化時對草銨膦的耐受濃度稍高于ROC22。

圖1 ROC22愈傷組織在不同草銨膦濃度中的轉綠率

2.2 愈傷組織在不同濃度草銨膦中的成苗情況

ROC22和粵糖93-159的愈傷組織在不同濃度的草銨膦中培養4周后的成苗情況見表1、圖3和圖4。

圖2 粵糖93-159愈傷組織在不同草銨膦濃度中的轉綠率

表1 愈傷組織在不同濃度草銨膦中的成苗情況

2個基因型甘蔗愈傷組織的成苗率隨著草銨膦濃度的提高而下降，且分化的成苗情況也隨之轉差。當草銨膦濃度為2.5 μmol/L時，愈傷組織雖然能部分分化出苗，但是苗的長勢很差，苗姿不正常，苗矮小，且葉片短小卷曲。

圖3 ROC22愈傷組織在不同草銨膦濃度中分化培養4周后的生長情況

圖4 粵糖93-159愈傷組織在不同草銨膦濃度中分化培養4周后的生長情況

2.3 剛分化4周小苗在不同濃度草銨膦中的致死率及生長情況

ROC22和粵糖93-159剛分化4周小苗在不同濃度草銨膦中培養4周后的致死率見圖5和圖6。草銨膦對2個基因型甘蔗剛分化小苗的致死率都隨著草銨膦濃度的升高而升高。根據趨勢線推算，草銨膦對ROC22剛分化小苗的LD50為5.5 μmol/L，對粵糖93-159剛分化小苗的LD50為6.6 μmol/L。

圖5 ROC22剛分化4周小苗在不同濃度草銨膦中的致死率

圖6 粵糖93-159剛分化4周小苗在不同濃度 草銨膦中的致死率

ROC22和粵糖93-159剛分化4周小苗在不同濃度草銨膦中培養4周后的生長情況見圖7和圖8。隨著草銨膦濃度的升高，小苗的生長情況均受到不良影響，2個基因型甘蔗之間差異不大，苗變矮小，分蘗減少，葉片變短小，葉色變淺、枯黃。當草銨膦濃度為7.5 μmol/L時，大部分小苗已枯黃死亡，存活的小苗也基本沒有生長，葉片短小并有褐斑。

圖7 ROC22剛分化4周小苗在不同濃度草銨膦中分化培養4周后的生長情況

3 結論

ROC22和粵糖93-159的愈傷組織轉綠率都隨著草銨膦濃度的升高而下降，這說明除草劑對愈傷組織的分化有負影響。不同基因型甘蔗的愈傷組織對除草劑的耐受濃度稍有差異。在本次試驗中草銨膦濃度為2.5 μmol/L時，2個甘蔗基因型愈傷組織的轉綠率均大于50%，從成苗的情況看，有很多愈傷組織雖然能轉綠，但隨著除草劑濃度的增加所成

苗的數量和質量都呈現下降趨勢，部分愈傷組織只轉綠而不能分化成小苗。所以結合成苗情況，適合草銨膦在甘蔗愈傷組織分化階段的篩選濃度為2.5 μmol/L。

草銨膦對ROC22和粵糖93-159剛分化4周小苗的致死率隨著處理濃度的增加而增高。不同基因型甘蔗剛分化的小苗對除草劑的耐受濃度稍有差異。在本試驗中根據趨勢線推算，草銨膦對ROC22剛分化小苗的LD50為5.5 μmol/L，對粵糖93-159剛分化小苗的LD50為6.6 μmol/L。從小苗的生長狀況看，當草銨膦濃度為5 μmol/L時存活的小苗矮小，葉片短小發黃，當草銨膦為7.5 μmol/L時，大部分小苗已枯黃死亡，存活的小苗也基本沒有生長，且葉片短小并有褐斑。因此結合小苗的生長狀況，對剛分化的小苗適合ROC22篩選的草銨膦濃度為5.5 μmol/L，適合粵糖93-159篩選的草銨膦濃度為6.6 μmol/L。

圖8 粵糖93-159剛分化4周小苗在不同濃度草銨膦中分化培養4周后的生長情況

4 討論

本試驗初步確立了ROC22和粵糖93-159愈傷組織分化階段和剛分化4周小苗的草銨膦篩選濃度，為日后的誘變育種、轉基因育種等后期抗性篩選階段提供參考。但同時不同基因型甘蔗品種的愈傷組織和剛分化小苗對草銨膦的耐受濃度均有差異，因此日后還需針對試驗的甘蔗品種做相應的篩選濃度試驗。

[1] 曹孜義. 實用植物組織培養技術教程[M]. 甘肅：甘肅科學技術出版社，2002：378.

[2] 羅正清，王文榮，劉少春，等. 臨滄蔗區田間雜草發生類型與化學除草技術[J]. 云南農業科技，2009(6)：52-54.

[3] 盧文潔，李文鳳，徐宏，等. 云南蔗園雜草發生與化學防除[J]. 江蘇農業科學，2011，39(6)：228-230.

[4] ZHANG Z Y, XING A Q, STASWICK P, et al. The use of glufosinate as a selective agent in Agrobacteriummediated transformation of soybean [J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 1999, 56(1)：37-46.

[5] 張宏軍，劉學，張佳，等. 草銨膦的作用機理及其應用[J]. 農藥科學與管理，2004，25(4)：23-27.

[6] 蘇少泉. 草銨膦述評[J]. 農藥，2005，44(12)：529-532.

[7] 高世武，許莉萍，郭晉隆，等. cryIA(c)基因表達載體構建與轉化甘蔗研究[C]//中國作物學會甘蔗專業委員會第十三次學術討論會，昆明，2008.

[8] 吳轉娣，劉新龍，姚麗，等. 根癌農桿菌介導的甘蔗遺傳轉化[J]. 湖南農業大學學報：自然科學版，2011，37(2)：150-155.

[9] 黃東杰，孫繼華. 甘蔗育種研究進展[J]. 熱帶農業科學，2012，32(1)：46-49, 53.

[10] 甘儀梅，張樹珍，曾凡云，等. 甘蔗轉基因育種研究進展[J]. 生物技術通報，2013(3)：1-9.

[11] 王倫旺. 廣西甘蔗理化誘變育種研究回顧與展望[J].廣西蔗糖，2002(2)：7-9.

[12] 安學麗，蔡一林，王久光，等. 化學誘變及其在農作物育種上應用[J]. 核農學報，2003，17(3)：239-242.

[13] KOCH A C, RAMGAREEB S, RUTHERFORD R S, et al. An in vitro mutagenesis protocol for the production of sugarcane tolerant to the herbicide imazapyr [J]. In Vitro Cell Dev-Pl, 2012, 48(4)：417-427.

(本篇責任編校：李金玉)

Studies on the Embryo Germination Medium and Plant Regeneration Medium with the Optimum Concentrations of Glufosinate-Ammonium for Sugarcane

HE Hui-yi, FAN Li-na, QI Yong-wen, LAO Fang-ye, DENG Hai-hua
(Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute/Guangdong Key Lab of Sugarcane Improvement & Biorefinery, Guangzhou 510316)

In vitro glufosinate-ammonium selection regimes were respectively used to screen plants regeneration from callus and regenerated shoots (data recorded 4w after embryogenic callus were transferred to embryo germination medium) of ROC22 and YT93-159 for glufosinate-ammonium tolerance in this study. The highseverity treatments with high glufosinate-ammonium concentration which resulted in the necrosis of embryo germination or regenerated shoots were different for the different sugarcane cultivars. In conclusion, when the selection of herbicide-tolerant cell lines of sugarcane was applied to embryogenic callus, incorporating 2.5 μmol/L glufosinate-ammonium into culture medium of embryo germination from callus of the two cultivars was the optimum. When the selection of herbicide-tolerant cell lines of sugarcane was applied to shoot regeneration, incorporating 5.5 μmol/L glufosinate-ammonium into culture medium of regenerated shoots of ROC22 was the optimum, and incorporating 6.6 μmol/L glufosinate-ammonium into culture medium of regenerated shoots of YT93-159 was the optimum.

Glufosinate-ammonium; Sugarcane; Concentration

S566.1

A

1005-9695(2015)01-0005-06

2014-11-25；

2015-01-13

本研究由廣東省科技計劃（2012A090300015; 2012B020301008; 2012A061400005）共同資助

何慧怡(1981-)，女，農藝師，主要研究方向：甘蔗遺傳育種；E-mial：emil06@126.com

*通訊作者：齊永文(1978-)，男，博士，高級農藝師，主要研究方向：甘蔗遺傳育種；E-mail：yongwen2001@163.com

何慧怡，樊麗娜，齊永文，等. 草銨膦在甘蔗愈傷分化階段和剛成苗階段篩選濃度的確定[J]. 甘蔗糖業，2015(1)：5-10.