鈣離子通道β2亞基基因rs4373814位點多態性與東北漢族人群原發性高血壓易感性的關聯研究

張海英，宋娟娟，李天曉，王懿，呂信鵬，周宏博，鄧穎

鈣離子通道β2亞基基因rs4373814位點多態性與東北漢族人群原發性高血壓易感性的關聯研究

張海英，宋娟娟，李天曉，王懿，呂信鵬，周宏博，鄧穎

目的：探索鈣離子通道β2亞基（CACNB2）基因rs4373814位點的多態性與東北漢族人群（黑龍江省及周邊地區）原發性高血壓易感性的關聯性。

方法：采用病例—對照研究方法，在哈爾濱醫科大學附屬第二醫院就診的患者中收集原發性高血壓患者1 006例作為病例組，體檢人群中隨機選取同期血壓正常者992例作為對照組，總計研究人群1 998例。應用Snapshot技術檢測CACNB2基因rs4373814位點單核苷酸多態性，利用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析處理。

結果：CACNB2基因rs4373814位點危險等位基因C的頻率分布在病例組和對照組間具有顯著性差異[P=0.039，比值比（OR）=1.068，95%可信區間（CI）：1.004～1.137]。經Logistic回歸校正性別、年齡、BMI、吸煙、飲酒后，發現顯性模型CC+GC/GG：增加高血壓患病風險（P=0.037，OR=1.260，95%CI：1.013～1.567）。

結論 ：CACNB2基因rs4373814位點單核苷酸多態性與東北漢族人群原發性高血壓的易感性存在顯著關聯。

原發性高血壓；CACNB2基因；單核苷酸多態性；關聯研究

Methods: A case-control study in Han population at northeastern of China was carried out and the research included 1998 participants as 2 groups: EH group, n=1006 patients treated in our hospital, and Control group, n=992 subjects with normal blood pressure from physical examination. The rs4373814 polymorphisms were examined by Snapshot technique and the statistical analysis was performed by SPSS 19.0 software.

Results: The rs4373814 risk allele C frequency of CACNB2 gene was significantly different between EH group and Control group, P=0.039, OR=1.068, 95% CI （1.004-1.137）. Logistic regression analysis showed that with adjusted gender, age, BMI, smoking, drinking, in dominant model, the genotype rs4373814 carring CC + GC/GG obviously increased the risk of EH occurrence, P=0.037, OR=1.260, 95% CI （1.013-1.567）.

Conclusion: The rs4373814 polymorphisms of CACNB2 gene are related to the susceptibility of EH occurrence in Han population at northeastern area of China.

1 998例受試者抽取空腹靜脈血300 μl，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，應用北京全式金公司生產的血液基因組DNA抽提試劑盒提取人血全基因組DNA（嚴格按試劑盒說明書進行操作）。經1.5%瓊脂糖凝膠電泳確認提取的人全基因組DNA產物片段完整和含量較高后，將DNA產物保存于-20℃冰箱。

1.3 單核苷酸多態性（SNP）檢測及基因型分析

影響血壓的環境因素主要包括：高鈉、低鉀膳食、肥胖、吸煙、飲酒、精神緊張等[1，2]。研究表明，原發性高血壓具有明顯的遺傳傾向，其遺傳度為30%～70%[3]。目前，隨著分子生物學的迅速發展以及人類基因組計劃的完成，從基因層面著手尋找原發性高血壓的發病原因已成為研究熱點。大量研究表明，鈣離子通道在原發性高血壓的發病機制中起著重要作用，其β2亞基通過與α1C亞基結合來調節鈣離子通道的電流強度、電壓依賴性、激活與失活特性，從而對血壓產生影響。近年來國際上的全基因組關聯分析（genome-wide association study, GWAS）已經發現了數十個高血壓的遺傳位點，其中鈣離子通道β2亞基（calcium channel β2 gene， CACNB2）基因的多態性在歐美、亞洲等地人群中已證實與原發性高血壓顯著關聯[4-7]。我國學者曾在南方地區漢族人群中進行了CACNB2基因多態性與原發性高血壓關聯的驗證性試驗，結果顯示，CACNB2基因多態性與漢族人群原發性高血壓的發生顯著關聯[8-11]。研究報道，中國漢族人群的基因頻率分布在南北地區存在差異，關于CACNB2基因rs4373814位點的多態性與原發性高血壓發生的關聯性研究在東北漢族人群中至今少見報道。本試驗擬研究CACNB2基因rs4373814位點與東北漢族人群原發性高血壓發生的關聯性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2012-05至2013-05我院住院患者和門診體檢患者共計1 998例，其中原發性高血壓患者（病例組）1 006例，血壓正常者（對照組）992例。所有研究對象均為長期居住在黑龍江省及周邊地區的漢族人群，且無血緣關系。

入選標準：病例組：參照2005年世界衛生組織及高血壓協會診斷標準，收縮壓≥140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）和（或）舒張壓≥90 mmHg，或血壓＜140/90 mmHg，且已確診為原發性高血壓，應用降壓藥物治療者，并排除繼發性高血壓、心肌病、先天性心臟病、風濕性心臟瓣膜病等。對照組：同期隨機選取門診體檢血壓正常者，收縮壓 ＜140 mmHg，舒張壓＜90 mmHg，且無高血壓家族史。所有入選對象均為40歲以上的成年人，無Brugada綜合征、孤獨癥、 注意力缺損多動障礙、躁狂癥、抑郁癥、精神分裂癥等精神類疾病。吸煙者定義為：每天吸煙5支及以上者，且連續吸煙時間超過6個月或戒煙小于1年。飲酒者定義為：每天飲酒250 ml及以上者，且連續飲酒時間超過1年或戒酒小于1年者。

所有入選研究對象均簽署知情同意書。研究得到哈爾濱醫科大學附屬第二醫院倫理委員會認可，研究內容符合《赫爾辛基宣言》。

1.2 基因組脫氧核糖核酸（DNA）的提取

采用Snapshot 方法檢測rs4373814位點的多態性。（1）聚合酶鏈式反應（PCR）擴增引物序列為F：ATTCCCCTGTAGGGCTATGA，R：AATTCTTTGCCTGCTTTTCTG。PCR反應總體積25 μl，其中包括2.5 μl 10×PCR buffer，0.8 μl MgCl2（50 mmol/L），0.5 μl dNTP（10 mmol/L），各0.5 μl的上、下游引物，1 μl模板DNA，0.2 μl tap酶（5U），19 μl ddH2O。反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，56℃復性30 s，72℃延伸30 s，共33個循環，最后72℃延伸5 min。（2）PCR擴增產物按照蝦堿酶方法純化，總體積為10 μl，其中包括PCR 產物2 μl ，SAP（1 U/μl）0.3 μl，Exo I（20 U/μl）0.2 μl，ddH2O 7.5 μl，震蕩混勻，37℃孵育90 min，75℃保溫15 min滅活SAP和ExoI酶，4℃保存24 h。（3）使用SNaPshot（ABI）試劑盒進行單堿基延伸反應，微測序引物序列為TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTGCATATTGTCCTTCTCCG，反應體積為3 μl，其中包括SNaPshot混合液1.5 μl，PCR產物1 μl和微測序引物0.5 μl。反應條件：96℃變性10 s，51℃復性5 s，60℃延伸30 s，共25個循環，最后4℃保存。（4）進行產物純化，反應總體積為5 μl，其中包括：延伸產物3 μl ，SAP（1 U/μl）0.3 μl，ddH2O 1.7 μl，震蕩混勻，37℃孵育1 h，75℃保溫 15 min滅活SAP酶，4℃保存24 h。（5）最后每個反應體系中加入1 μl上述純化延伸產物，與0.2 μl的GenescantTM-120LIZ Size Stangard和8.8 μl去離子甲酰胺混勻后，95℃變性 5 min，再利用ABI公司的ABI13730測序儀和GeneMapper 4.0軟件對SNP位點進行基因分型?；?/p>

因分型檢出率99.9%。

1.4 統計學方法

應用SPSS 19.0 統計軟件進行數據分析處理。計量資料數據采用均數±標準差表示，兩組間的差異采用t 檢驗。計數資料用頻數（%）表示，采用χ2檢驗分析對照組的等位基因頻率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律（HWE）。病例組與對照組間的等位基因頻率、性別、吸煙、飲酒的分布差異采用χ2檢驗，并計算比值比（OR）值及95%可信區間（CI）。采用Logistic回歸檢驗rs4373814位點基因型在病例—對照組中的分布規律。所有統計采用雙側概率檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般臨床資料比較（表1）

兩組間的年齡、性別、體重指數（BMI）、飲酒、吸煙差異均無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 CACNB2基因rs4373814等位基因頻率分布的差異

本研究的CACNB2基因位點rs4373814的基因頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（P=0.827），選取樣本具有群體代表性。千人基因組計劃顯示了不同人群間rs4373814最小等位基因頻率，非洲：0.602，美國：0.439，歐洲：0.479，東亞：0.535，中國北京：0.545，中國南方：0.577。本研究對照組為0.537，與千人基因組計劃的東亞和中國北京最小等位基因符合。CACNB2基因位點rs4373814危險等位基因C在病例組分布頻率為0.570，病例組分布頻率明顯高于對照組（0.537），差異有統計學意義（P=0.039，OR=1.068，95%CI：1.004～1.137）。

2.3 不同遺傳模型的rs4373814基因型頻率與高血壓患者的關聯分析（表2）

經Logistic回歸校正性別、年齡、BMI、吸煙、飲酒后，發現顯性模型CC+GC/GG增加高血壓患病風險（P=0.037，OR=1.260，95%CI：1.013～1.567）。加性模型CC/GG、GC/GG和隱性模型CC/GC+GG未增加高血壓患病風險（CC/GG：P=0.031，OR=1.316，95%CI：1.025～1.689；GC/GG： P=0.486，OR=1.075，95%CI：0.878～1.316；CC/GC+GG：P=0.168，OR=1.143，95%CI：0.945～1.382）。

表1 一般臨床資料比較

表2 不同遺傳模型下rs4373814基因型頻率與高血壓患病的關聯分析

3 討論

高血壓是最常見的慢性病，其影響了10%～20%成年人的健康[10]。因此，識別導致高血壓的基因變異不僅可以提高對疾病病理生理過程的理解，也能闡明其生化和生理途徑中涉及的諸多危險因素[12]。

本試驗選取中國東北（黑龍江省及周邊地區）漢族人群，進行了CACNB2基因rs4373814位點與原發性高血壓的關聯性研究。黑龍江省為我國高血壓高發區，從1958年～2007年5次流行病學調查顯示，該地區高血壓的患病率分別為8.26%、9.65%、11.87%、17.06%和25.69%，患病率始終高于全國的平均水平，且呈逐年增高的趨勢[13]。究其原因主要有以下幾個方面：黑龍江省氣候寒冷，冬季持續時間較長，且久居于此的人群大部分有高鹽低鉀、高脂肪和高熱量飲食習慣，且飲酒、吸煙者比例較高，吸煙、飲酒量也較大。相關因素分析認為高血壓與高血壓家族史、年齡、性別、職業、吸煙、飲酒、BMI等因素存在多元線性關系，其中高血壓家族史是其發病的主要相關因素[13]。高血壓與基因多態性的關聯存在人群異質性，因此本試驗對黑龍江省漢族人群進行高血壓遺傳基因的研究，對于驗證GWAS的基因變異在不同地區人群作用具有重要意義。

CACNB2基因位于10p12區域，共有20個外顯

子，基因組大小約400 kb，有4個不同的轉錄起始位點，通過選擇性剪切，總共轉錄10多種轉錄體。電壓依賴性L型鈣離子通道（Voltage-dependent L-type calcium channel, L-VDDC）包括α1、α2δ和β亞單位，其中β亞基還有4個亞型（β1、β2、β3、β4）。鈣離子通道β2亞單位主要通過與α亞基結合調節L-VDDC的電流強度、電壓依賴性、激活與失活特性，從而對動脈血壓的變化形成一定的影響[14]。因此，CACNB2基因位點的變異能夠影響蛋白水平的表達，從而導致血壓的變化[15]。

本研究較早在中國北方漢族人群驗證CACNB2基因rs4373814位點多態性與中國北方漢族原發性高血壓的關聯性，發現CACNB2基因rs4373814位點的高血壓危險等位基因為C，并且在病例組分布頻率高于對照組，差異有統計學意義（P=0.039，OR=1.068，95%CI：1.004～1.137）。經Logistic回歸校正性別、年齡、BMI、吸煙、飲酒后，進行不同遺傳模型的CACNB2基因型分布的差異性分析，僅在顯性模型下發現該位點風險等位基因基因型CC+GC/GG 顯著增加了高血壓的患病風險（P=0.037，OR=1.260，95%CI：1.013～1.567），而加性模型和隱性模型下基因型的差異未影響到高血壓的發病。 Ehret 等[16]對69 395例歐洲個體進行了Meta分析，結果同樣顯示CACNB2基因rs4373814位點與高血壓的易感性密切相關，危險等位基因為C（P=8.5×10-8）。該結論與我們的研究結果相一致， Hong 等[10]在我國福建省漢族人群中，進行了CACNB2基因rs4373814位點與高血壓關聯性驗證，結果顯示，顯性模型下C/G+G/G基因型使高血壓的風險降低（P=0.022，OR=0.70，95%CI：0.51～0.95）。該結果同樣說明rs4373814位點的等位基因C為危險等位基因，與我們的研究結果一致。由此可以得出結論，CACNB2基因rs4373814多態性與中國漢族人群原發性高血壓的易感性存在顯著相關性，等位基因C可能會增加漢族人群原發性高血壓的發病風險。

綜上所述，我們的研究證實了CACNB2基因rs4373814的遺傳多態性與高血壓易感性的顯著關聯，為原發性高血壓的預防或藥物靶點的治療提供了實驗基礎。同時這也為我們對原發性高血壓產生了新的理解，將管理的重點轉向預防而不是治療。高血壓是遺傳基因與許多致病性增壓因素和生理性減壓因素相互作用而引起的復雜疾病，單個基因的單個位點對原發性高血壓的發病危險的作用極其微弱。同時高血壓受到多基因與環境因素等共同作用，多基因之間與基因—環境的交互作用則有待于進一步研究。因此，我們的研究需要進一步在大流行病學樣本中被驗證和進行功能學研究。

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Association Study Between the rs4373814 Polymorphisms of Calcium Channel Gene and the Susceptibility of Essential Hypertension in Han Population at Northeastern Area of China

ZHANG Hai-ying, SONG Juan-juan, LI Tian-xiao, WANG Yi, LV Xin-peng, ZHOU Hong-bo, DENG Ying.
Department of Emergency, The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin （150086）, Heilongjiang, China

Objective: To investigate the relationship between rs4373814 polymorphisms of calcium channel （CACNB2） gene and the susceptibility of essential hypertension （EH） occurrence in Han population at northeastern area of China.

Essential hypertension; Calcium Channel gene; Single nucleotide polymorphism; Association study（Chinese Circulation Journal, 2015,30:661.）

2015-01-04）

（編輯：漆利萍）

黑龍江省自然科學基金（D201204）

150086 黑龍江省哈爾濱市，哈爾濱醫科大學附屬第二醫院 急診醫學科（張海英、宋娟娟、呂信鵬、鄧穎）；哈爾濱醫科大學生物化學與分子生物學教研室（李天曉、周宏博），生物技術實驗教學中心（王懿）

張海英 碩士研究生 主要從事急危重癥的搶救，中毒的治療等研究 Email: zhanghaiyinggys@163.com 通訊作者：鄧穎

Email：ldlrrr@163.com

R541

A

1000-3614（2015）07-0661-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.07.012