重組人血管內皮抑制素單藥對非小細胞肺癌腫瘤血管微環境影響的初步研究

沈鈺新，趙偉新，王升平，陳佳艷,3，劉 笛，蔣國，樊

1. 復旦大學附屬腫瘤醫院放療科，復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海200032 ；

2. 復旦大學附屬腫瘤醫院放射診斷科，復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海200032 ；

3. 南京醫科大學附屬南京第一醫院放療科，江蘇 南京 210006

重組人血管內皮抑制素單藥對非小細胞肺癌腫瘤血管微環境影響的初步研究

沈鈺新1，趙偉新1，王升平2，陳佳艷1,3，劉 笛1，蔣國1，樊1

1. 復旦大學附屬腫瘤醫院放療科，復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海200032 ；

2. 復旦大學附屬腫瘤醫院放射診斷科，復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海200032 ；

3. 南京醫科大學附屬南京第一醫院放療科，江蘇 南京 210006

背景與目的：臨床數據顯示對于局部晚期或晚期非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，重組人血管內皮抑制素(恩度)聯合放療或化療較傳統化放療可能更具優勢，但其機制，特別是對血管微環境的影響依舊不甚明確。該研究通過CT灌注成像技術(dynamic contrast-enhanced perfusion computed tomography，CT perfusion)對NSCLC腫瘤局部血流灌注進行定量分析，評估恩度單藥對NSCLC腫瘤血管微環境的影響。方法：經細胞學或組織學確認的初治ⅢB/Ⅳ期NSCLC患者可入組本研究。全部患者接受7.5 mg/m2恩度單藥治療14 d，于基線期及治療后分別接受CT灌注成像檢查，獲取灌注圖像并定量分析血流灌注參數：血流量(blood flow，BF)、血容量(blood volume，BV)以及血管表面通透性(permeability surface，PS)。結果：7例患者(4例為ⅢB期，3例為Ⅳ期)入組，均完成基線期及恩度單藥治療后CT灌注掃描。血流灌注參數BF、BV、PS的中位值于治療前后分別為27.1/48.9 mL·(100 mL·min)-1、86.8/84.8 mL·100 mL-1以及45.0/54.0 mL·(100mL·min)-1。經過14 d恩度單藥治療，腫瘤BF值較治療前顯著上升(P=0.028)，而BV值與PS值變化無統計學意義(BV：P=0.398；PS：P=0.237)。結論：恩度單藥治療局部晚期或晚期NSCLC后，可導致腫瘤局部灌注血流量明顯上升而通透性和血容量則變化不明顯。

非小細胞肺癌；內皮抑素；CT灌注成像；腫瘤微環境

2014中國腫瘤登記年報顯示：在我國肺癌已成為發病率及死亡率均為第一的惡性腫瘤。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌總體80%～85%，由于其起病隱匿，約80%患者初診時已失去手術機會［1-2］。近年來，多項臨床研究顯示，重組人血管內皮抑制素(Endostar，恩度)聯合化放療治療局部晚期或晚期NSCLC，相比傳統化、放療，具有提高總有效率、局控率且安全性好等優勢［3-7］。然而，其作用機制尚不明確，且恩度單藥作用于NSCLC腫瘤內微血管的直接效應也研究甚少。

CT灌注成像(dynamic contrast-enhanced perfusion computed tomography，CT-p)作為一種無創的、定量分析并獲取腫瘤局部灌注圖像的新技術，已廣泛用于評估肺癌、肝癌和頭頸部鱗癌等多種腫瘤的血管生成狀態［8-10］。本研究采用CT灌注成像技術，通過對腫瘤局部血流灌注進行定量分析，評估恩度單藥對局部晚期或晚期NSCLC腫瘤內微血管的影響，為探討恩度聯合化放療的作用機制提供部分依據。

1 資料和方法

1.1 入組與排除標準

本研究通過復旦大學附屬腫瘤醫院倫理委員會審核。入組標準為：(1) 細胞學或組織學確認的NSCLC；(2) 無法根治性切除局部晚期或晚期NSCLC；(3) PS評分0～1分；(4) 預計生存期≥12周；(5) 足夠的器官和骨髓功能儲備；(6) 能理解本研究并已簽署知情同意書。排除標準：(1) 進行過針對原發疾病的抗腫瘤治療；(2) 伴有CT灌注成像或恩度治療的禁忌證。

1.2 治療與評價方案

重組人血管內皮抑制素注射液由山東先聲麥得津生物制藥有限公司生產(國藥準字S20050088，每支15 mg/3 mL，2.4×105U/支)。全部患者接受7.5 mg/m2恩度單藥治療14 d，于基線期及治療后分別接受CT灌注成像檢查，獲取灌注圖像并定量分析血流灌注參數。

1.3 CT灌注掃描設備及參數

研究采用Siemens 64多層螺旋CT掃描儀(Siemens Definition；Siemens Medical Solutions，Forchheim，Germany)進行檢查。首先，行常規CT平掃，確定病變部位及灌注掃描范圍。確定腫塊后，將包括腫塊最長徑層面的相鄰4層選定為靶層面，行CT灌注掃描。通過高壓注射器經肘正中靜脈注入非離子型對比劑優維顯(Ultravist，370 mg I/mL) 50 mL，流速5 mL/s。灌注掃描模式采用多層連續動態電影掃描，電壓120 kV，電流50 mAs，重建層厚為4×7.2 mm，數據采集時間為50 s，延遲時間0 s (即注射對比劑與灌注掃描同時開始)。

1.4 灌注參數圖像分析

將掃描所得200幅(每層50幅，4層)圖像數據傳送至Siemens專用圖像處理工作站(CT workplace；Siemens Healthcare，Erlangen，Germany)，采用預裝的Syngo Body Perfusion CT(Syngo 2006G；Siemens Medical Solutions)軟件處理數據。由1名資深放射科醫師進行腫瘤感興趣區(Region of interest，ROI)的勾畫及測量。對于腫瘤區域ROI的選擇，避開明顯的壞死、鈣化區域，盡最大可能覆蓋病灶，但不選取腫瘤邊緣。選用Lung Cancer灌注專用子軟件分析并獲取血流量(blood flow，BF)、血容量(blood volume，BV)以及血管表面通透性(permeability surface，PS)參數。

1.5 統計學處理

所有數據均采用SPSS 20.0進行統計處

2 結 果

2.1 一般資料

自2009年7月—2010年6月，7例初診于復旦大學附屬腫瘤醫院的患者入組本研究。其中男性6例，女性1例；中位年齡51歲(46～64歲)；4例為ⅢB期，3例為Ⅳ期(惡性胸腔積液2例，腦轉移1例)；T2a1例，T2b5例，T31例；N21例，N36例；M04例，M1a2例，M1b1例。所有患者均經細胞學或組織學病理證實為NSCLC，其中，腺癌5例，鱗癌2例。

2.2 CT灌注參數

全部患者均接受基線期及恩度單藥治療后CT灌注掃描。

7例患者基線期CT灌注參數BF、BV、PS的中位值分別為21.7 mL·(100 mL·min)-1、86.8 mL·100 mL-1以及45 mL·(100 mL·min)-1。經過14 d恩度單藥治療，BF、BV、PS參數中位值分別為48.9 mL·(100 mL·min)-1、84.8 mL·100 mL-1以及54.0 mL·(100 mL·min)-1。對治療前后兩組數據進行Wilcoxon符號秩檢驗，結果顯示，腫瘤BF值較治療前顯著上升(P=0.028)，而BV值與PS值變化無統計學意義(BV：P=0.398；PS：P=0.237)。表1所示為治療前后灌注參數變化及相關系數。

恩度單藥治療后，患者BF值平均上升至基線期2.04倍(范圍：0.87～3.20)，絕對值提高了(18.8±18.5) mL·(100 mL·min)-1。而BV、PS值較基線期平均上升至1.70倍(范圍：0.71～5.57)以及1.26倍(范圍：0.82～1.89)，絕對值較基線期分別上升了(14.1±32.0) mL·100 mL-1、(7.63±16.0) mL·(100 mL·min)-1。圖1～3所示為各患者接受恩度治療前后血流灌注參數變化。圖4所示為1名58歲男性患者ROI勾畫選擇以及治療前后血流灌注圖像。該患者初診為右上肺腺癌伴腦轉移(Ⅳ期，T2bN3M1b)，恩度治療后，其BF值較基線期上升了70%，BV值升高30%，而PS值較治療前下降了15%。腫瘤局部BF值或BV值越高提示局部血供越豐富，PS值越高提示血管表面通透性越強。通過CT灌注圖像，我們可以直觀地看出該患者接受恩度治療后腫瘤局部血供(BF、BV值)較基線期上升，而血管表面通透性(PS值)較治療前有所下降。

圖 1 各例患者治療前后血流量參數值Fig. 1 Blood flow (BF) changes before and after Endostar monotherapy in all 7 cases

表 1 恩度治療前后灌注參數Tab. 1 Changes in functional parameters before and after endostar monotherapy

圖 2 各例患者治療前后血容量參數值Fig. 2 Blood volume (BV) changes before and after Endostar monotherapy in all 7 cases

圖 3 各例患者治療前后血管表面通透性參數值Fig. 3 Permeability surface (PS) changes before and after Endostar monotherapy in all 7 cases

圖 4 1例患者基線期及恩度治療后CT灌注圖像Fig. 4 Axial CT and CT perfusion imaging in a 58-year-old male patient with a diagnosis of stage Ⅳ adenocarcinoma of the right upper lobe at baseline and after Endostar treatment

3 討 論

自1971年，Folkman［11］教授提出惡性腫瘤的生長與轉移依賴于新生血管生成這一學說，抗血管生成治療作為一項靶點獨特、可協同治療、不易耐藥、低毒性且抗腫瘤應用廣譜的治療策略［12-13］，已成為部分腫瘤一線治療推薦方案。1997年，O’Reilly等［14］發現了一種新的內源性抗血管生成因子——內皮抑素(Endostatin)，能夠特異性抑制腫瘤血管內皮細胞的增殖、遷移以及生成。1999年，由我國研究人員自主研發的重組人血管內皮抑制素注射液——恩度問世，并于2005年被國家食品藥品監督管理局批準聯合化療應用于復發和轉移的NSCLC的治療［15］。

已有多項臨床研究顯示，對于晚期

NSCLC，恩度聯合化療較單純化療更有優勢。2005年的一項多中心Ⅲ期臨床試驗提示，晚期NSCLC中恩度聯合長春瑞濱+順鉑(NP)方案較單純NP化療組，總有效率分別為35.4%、19.5%(P=0.0003)，中位腫瘤進展時間分別為6.3及3.6個月(P=0.0000)［7］。2011年，一項隨機Ⅱ期臨床研究［6］顯示，恩度聯合紫杉醇+卡鉑(TP)方案治療晚期NSCLC，其疾病控制率較單純化療組顯著提高(P= 0.004)。同年12月，Ge等［5］通過對15個臨床試驗1 335例患者進行薈萃分析，再次證明恩度聯合鉑類藥物為基礎的化療方案能夠提高晚期NSCLC治療的總有效率，且有較好的安全性。

不僅用于協同化療，恩度聯合放療的優勢在近幾年的研究中也逐漸被認可。2011年，Jiang等［3］通過對比恩度聯合放療以及單純放療的各25例Ⅰ～Ⅲ期NSCLC患者，發現恩度組較單純放療組具有更高的總有效率以及更優的1年、2年局控率。2014年，Bao等［4］報道的一項Ⅱ期臨床試驗顯示，與既往研究相比，恩度聯合化、放綜合治療對于提高Ⅲ期NSCLC患者的生存期及局控率具有潛在優勢。

盡管臨床數據顯示恩度能夠提高化放療敏感性，但其作用機制尚不明確。主流觀點認為，內皮抑素通過干擾血管內皮細胞生長因子、成纖維細胞生長因子信號轉導通路，誘導內皮細胞停滯在G1期，誘導內皮細胞凋亡，阻止內皮細胞黏附移行，從而特異性抑制腫瘤血管內皮細胞的增殖、遷移以及生成［16-20］。2014年，Deng等［21］通過對接受單純化療與恩度聯合化療的晚期食管癌患者進行對比，發現接受2個周期(42 d)治療后，聯合治療組腫瘤血流灌注參數BF、BV、PS以及腫瘤VEGF 表達較單純化療組均明顯下降(P＜0.05)，且VEGF表達與BF、BV值呈正相關。鄭心婷等［22］將24例晚期NSCLC分為恩度聯合化療組以及單純化療組，同樣發現聯合治療組接受治療(≥42 d)后BF值較治療前明顯下降，且下降幅度高于單純化療組。

多數研究探討的是恩度聯合抗腫瘤治療后腫瘤的血流動力學改變，為了進一步了解恩度單藥對NSCLC腫瘤微血管的直接影響，本研究通過運用CT灌注掃描，對接受14 d恩度單藥治療的局部晚期或晚期NSCLC患者進行監測。結果顯示，接受恩度治療后，患者腫瘤局部灌注BF值較治療前顯著上升。這一結果與2012年Jiang等［23］報道相一致。該研究顯示，恩度治療5 d后，10例Ⅱ/Ⅲ期NSCLC患者的BF值較基線期出現明顯上升。

以上數據顯示，恩度聯合化療綜合治療后腫瘤BF值會下降，而單藥治療后卻呈上升趨勢。究其原因，結合既往研究，我們認為可能與接受抗血管治療后早期腫瘤血管正?；F象相關。2005年，Jain［24］首次提出抗血管生成治療初期可能導致腫瘤血管出現短期“正?；爆F象。2013年，Meng等［25］通過測定恩度治療后路易斯肺癌(Lewis lung carcinoma，LLC)小鼠模型腫瘤的細胞凋亡、微血管密度、壁細胞血管的形態以及腫瘤缺氧的情況，提出恩度可能通過減少微血管密度，同時增加血管內皮的周細胞覆蓋對腫瘤血管進行重塑，繼而出現血管正?；F象。本研究中，患者接受恩度治療后，腫瘤CT灌注BF值較治療前明顯上升。相對于正常血管，腫瘤新生血管由于發育不成熟，其血流灌注量較低。同時，腫瘤血流量升高，可能進一步提高對藥物以及氧的運輸能力，從而提高化療以及放療的治療效力。

綜上所述，恩度單藥治療局部晚期或晚期NSCLC，可導致患者腫瘤局部灌注BF上升，這可能與恩度提高化放療敏感性相關。然而，由于患者數量有限且檢測方法單一，我們后續將擴大樣本量，同時聯合MR彌散加權成像［26］、正電子發射計算機斷層顯像(PET/CT)等技術，進一步闡述恩度單藥及聯合化療對NSCLC腫瘤血管及微環境的影響。

［1］ SIEGEL R, MA J, ZOU Z, et al. Cancer statistics, 2014［J］. CA Cancer J Clin, 2014, 64(1)： 9-29.

［2］ CARNIO S, NOVELLO S, MELE T, et al. Extending survival of stage Ⅳ non-small cell lung cancer［J］. Semin Oncol,

2014, 41(1)： 69-92.

［3］ JIANG X D, DAI P, WU J, et al. Effect of recombinant human endostatin on radiosensitivity in patients with non-small-cell lung cancer［J］. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2012, 83(4)：1272-1277.

［4］ BAO Y, PENG F, ZHOU Q C, et al. Phase Ⅱ trial of recombinant human endostatin in combination with concurrent chemoradiotherapy in patients with stage Ⅲ non-small-cell lung cancer［J］. Radiother Oncol, 2015, 114(2)： 161-166.

［5］ GE W, CAO D D, WANG H M, et al. Endostar combined with chemotherapy versus chemotherapy alone for advanced NSCLCs： a meta-analysis［J］. Asian Pac J Cancer Prev, 2011, 12(10)： 2705-2711.

［6］ HAN B, XIU Q, WANG H, et al. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled study to evaluate the efficacy of paclitaxel-carboplatin alone or with endostar for advanced non-small cell lung cancer［J］. J Thorac Oncol, 2011, 6(6)： 1104-1109.

［7］ 王金萬, 孫 燕, 劉永煜, 等. 重組人血管內皮抑素聯合NP方案治療晚期NSCLC隨機、雙盲、對照、多中心Ⅲ期臨床研究［J］. 中國肺癌雜志, 2005, 8(04)： 283-290.

［8］ MILES K A, LEE T Y, GOH V, et al. Current status and guidelines for the assessment of tumour vascular support with dynamic contrast-enhanced computed tomography［J］. Eur Radiol, 2012, 22(7)： 1430-1441.

［9］ FRAIOLI F, VETERE S, ANILE M, et al. Computed tomography perfusion： a new method to evaluate response to therapy in lung cancer［J］. J Thorac Oncol, 2011, 6(9)：1599-1600.

［10］ GARCIA-FIGUEIRAS R, GOH V J, PADHANI A R, et al. CT perfusion in oncologic imaging： a useful tool?［J］. AJR Am J Roentgenol, 2013, 200(1)： 8-19.

［11］ FOLKMAN J. Tumor angiogenesis： therapeutic implications［J］. N Engl J Med, 1971, 285(21)： 1182-1186.

［12］ WU J M, STATON C A. Anti-angiogenic drug discovery：lessons from the past and thoughts for the future［J］. Expert Opin Drug Discov, 2012, 7(8)： 723-743.

［13］ 黃 誠, 張 晶, 柯明耀, 等. 貝伐單抗聯合化療治療晚期多程治療失敗后的非小細胞肺癌臨床觀察［J］. 中國癌癥雜志, 2012, 22(1)： 47-51.

［14］ O’REILLY M S, BOEHM T, SHING Y, et al. Endostatin： an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth［J］. Cell, 1997, 88(2)： 277-285.

［15］ 常國棟, 李壯林, 秦加陽, 等. 重組人血管內皮抑制素(rh-Endostatin)大腸桿菌表達體系發酵條件的優化［J］. 生物工程學報, 2005, 21(04)： 662-666.

［16］ ABDOLLAHI A, HAHNFELDT P, MAERCKER C, et al. Endostatin’s antiangiogenic signaling network［J］. Mol Cell, 2004, 13(5)： 649-663.

［17］ HANAI J, DHANABAL M, KARUMANCHI S A, et al. Endostatin causes G1 arrest of endothelial cells through inhibition of cyclin D1［J］. J Biol Chem, 2002, 277(19)：16464-16469.

［18］ LING Y, YANG Y, LU N, et al. Endostar, a novel recombinant human endostatin, exerts antiangiogenic effect via blocking VEGF-induced tyrosine phosphorylation of KDR/Flk-1 of endothelial cells［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2007, 361(1)： 79-84.

［19］ LU N, LING Y, GAO Y, et al. Endostar suppresses invasion through downregulating the expression of matrix metalloproteinase-2/9 in MDA-MB-435 human breast cancer cells［J］. Exp Biol Med (Maywood), 2008, 233(8)： 1013-1020.

［20］ LING Y, LU N, GAO Y, et al. Endostar induces apoptotic effects in HUVECs through activation of caspase-3 and decrease of Bcl-2［J］. Anticancer Res, 2009, 29(1)： 411-417.

［21］ DENG W Y, SONG T, LI N, et al. Clinical observation and therapeutic evaluation of Rh-endostatin combined with DP regimen in treating patients with advanced esophageal cancer［J］. Asian Pac J Cancer Prev, 2014, 15(16)： 6565-6570.

［22］ 鄭心婷, 林麗珠, 楊賢衛. CT灌注成像對非小細胞肺癌化療及血管靶向治療療效的評價［J］. 中國腫瘤臨床與康復, 2012, 19(03)： 254-257.

［23］ JIANG X D, DAI P, QIAO Y, et al. Clinical study on the recombinant human endostatin regarding improving the blood perfusion and hypoxia of non-small-cell lung cancer［J］. Clin Transl Oncol, 2012, 14(6)： 437-443.

［24］ JAIN R K. Normalization of tumor vasculature： an emerging concept in antiangiogenic therapy［J］. Science, 2005, 307(5706)： 58-62.

［25］ MENG M B, JIANG X D, DENG L, et al. Enhanced radioresponse with a novel recombinant human endostatin protein via tumor vasculature remodeling： experimental and clinical evidence［J］. Radiother Oncol, 2013, 106(1)： 130-137.

［26］ 沈麗娟, 周良平. 磁共振彌散加權成像技術在腎臟腫瘤診斷中的研究和進展［J］. 中國癌癥雜志, 2014, 24(5)： 387-391.

Microenvironment changes induced by Endostar monotherapy in patients with non-small cell lung

cancer: a pilot study

SHEN Yuxin1, ZHAO Weixin1, WANG Shengping2, CHEN Jiayan1,3, LIU Di1,

JIANG Guoliang1, FAN Min1(1.Department of Radiation Oncology, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China; 2.Department of Radiology, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China; 3.Department of Radiation Oncology, Nanjing First Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Nanjing 210006, Jiangsu, China)

FAN Min E-mail: fanming@fudan.edu.cn

Background and purpose: Clinical data show that Endostar, a recombinant human endostatin, has the therapeutic benefit for patients with non-small cell lung cancer (NSCLC) while combined with chemotherapy or radiotherapy. However, the microenvironment changes induced by Endostar monotherapy in NSCLC is not yet clear. The purpose of this study was to prospectively study tumor vascular effects of Endostar monotherapy in patients with locally advanced or advanced NSCLC by dynamic contrast-enhanced perfusion computed tomography (CT perfusion, CT-p). Methods: Previously untreated patients with histologically or cytologically confirmed locally advanced or advanced NSCLC were eligible. All patients received daily Endostar (7.5 mg/m2) for 14 days. CT-p scans were acquired at the baseline and post-treatment. CT-p parameters, such as blood flow (BF), blood volume (BV) and permeability surface PS (area product), were measured in all patients. Results: Of all 7 patients enrolled, four were staged as ⅢB and three as stage Ⅳ (2 with malignant pleural effusion, 1 with brain metastasis). The median BF, BV and PS values of baseline

Non-small cell lung cancer; Endostatin; CT perfusion; Microenvironment

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.10.011

R734.2；R73-37

A

1007-3639(2015)10-0817-06

2015-03-26

2015-05-28）

樊旼 E-mail:fanming@fudan.edu.cn

and post-treatment were 27.1/48.9 mL/100 mL/min, 86.8/84.8 mL/100 mL and 45.0/54.0 mL/100 mL/min, respectively. After administration of Endostar for 14 days , BF showed a significant increase compared with that at baseline (P=0.028), whereas no significant changes were found in BV (P=0.398) and PS (P=0.237) values. Conclusion: Our results suggest that Endostar monotherapy induces a significant increase in BF whereas no significant difference in BV and PS.