新生小鼠肺組織取材方法的改進

張國強 翟 艷 孫阿林 張立明

1（濰坊醫學院 兒科學教研室，濰坊261053）

2（濰坊市人民醫院 健康查體中心，濰坊261041）

3（濰坊醫學院 內科學教研室，濰坊261053）

4（濰坊市人民醫院 新生兒科，濰坊261041）

在呼吸系統相關疾病研究中，將肺組織進行石蠟包埋后切片是最基本的方法。文獻報道肺組織取材方法各異，總結如下：直接取材；在體／離體氣管灌注后取材［1，2］。筆者實驗發現，前述方法對大鼠或者成年小鼠效果較好，但對于新生鼠特別是新生小鼠，因其重量小、氣管管徑小、呼吸系統發育不完善，不易準確進行氣管灌注。勉強進行灌注后，也極易造成肺泡結構損傷。對于新生小鼠，實驗發現采用肺循環聯合體循環灌注后對組織進行修塊的方法，可以制作出較為理想的新生小鼠肺組織切片，為新生小鼠實驗提供可靠取材方法。

1 材料

新生5天的昆明小鼠16只，每組4只，體重（3．17±0．16）g；1．2一次性使用靜脈輸液器（規格：0．45×13．5RWLB）；1．3生理鹽水（NS）、4%多聚甲醛（PFA）、石蠟包埋機、梯度酒精、二甲苯、石蠟切片機、烤箱、HE染色劑、顯微鏡等。

2 方法

新生小鼠乙醚麻醉后，打開腹腔、胸腔并充分暴露心肺，注意勿傷及心肺組織。

方法A：未行灌注，剪斷腹主動脈、下腔靜脈放血處理后取材；

方法B：腹腔放血后行氣管灌注：將靜脈輸液器針頭直接插入氣管并固定后緩慢灌注PFA至肺組織充盈后取材；

方法C：未行腹腔放血，行肺循環、體循環灌注后取材：先剪開左心耳，于右心室位置插入靜脈注射器針頭3mm左右，借助心臟搏動用NS行肺循環灌注，至肺組織變白、左心耳出無血液流出；剪開右心耳并將針頭插入左心室行體循環灌注至肝臟變為土黃色、右心耳無血液流出；采取同樣辦法，PFA分別行肺／體循環灌注2～3min后取材。注意灌注速度不宜過快，保持40滴／每分，避免肺組織水腫。

取肺方式：左肺于肺門處結扎、剪下，于NS中漂去表面血跡，將肺組織修剪為2×4×6mm左右大小，然后浸入PFA中固定24～48小時，后續水洗、脫水、透明、浸蠟、切片、HE染色按常規操作。

3 結果

方法A：肺組織結構紊亂，紅細胞廣泛分布（見圖1A）；方法B：肺組織結構發生明顯變形，紅細胞殘留（見圖1B）；方法C：肺組織結構良好，無紅細胞殘留（見圖1C）。

4 討論

新生小鼠肺結構發育不成熟。文獻報道，生后5天的小鼠肺組織處于囊泡期［］。腹腔放血后直接取材，肺組織結構不完整，紅細胞廣泛分布；若腹腔放血后后行氣管灌注，在灌洗液的作用下，肺組織結構將發生明顯變形；因肺組織為雙重供血（肺循環供血與起源于體循環的支氣管動脈供血），因此分別行肺循環、體循環灌注，可以最大限度保持肺組織形態，減少肺內血液殘留，經HE染色證實，此方法獲得的肺組織結構良好，無紅細胞殘留。

圖1 不同方法獲取的新生小鼠肺組織HE染色結果

取材后修塊的目的在于使肺組織厚度減小，利于固定液滲入；形態規整的組織塊亦可以避免二甲苯透明時因肺組織形態不規則而發生卷曲變形，影響后續切片。

5 結論

采取肺／體循環雙重灌注后修塊的的方式可以最大限度保持新生小鼠肺組織形態，是新生小鼠肺組織切片的理想方法。

［1］ 李冰，劉同慎．肺組織切片的取材和固定新方法［J］．生物學通報，2013，01：61-62．

［2］ 尚宏偉，李寶紅，王興翠，等．大鼠肺組織制片方法的改進［J］．首都醫科大學學報，1999，02：55-56．

［3］ Ten Have-Opbroek AA．The development of the lung in mammals：an analysis of concepts and findings［J］．Am J Anat，1981，162（3）：201-19．