體外培養條件下SCF與RA對昆明小鼠精原干細胞增殖的影響

劉 茜 余榮嬌 張 凱 洪 燕 劉向國

（安徽中醫藥大學 組胚生物學教研室，合肥230008）

精原干細胞（spermatogonial stem cells，SSCs）是生長于生精小管上皮近基底膜區域的雄性生殖干細胞，是精子發生的起始細胞，它既能自我增殖，又能分化成為精母細胞，從而維持體內精子數量的恒定，對維持機體的繁殖能力起重要作用。SSCs是雄性動物中唯一能將遺傳信息傳遞給后代的干細胞，具有很強的可塑性，但人們對其中許多發育和調控機制并不太了解。文獻報道干細胞因子 （stem cell factor，SCF）［1］和維生素 A（VA）［2］對小鼠精原干細胞體外增殖發揮一定的作用，但兩種因素之間有無交互作用尚無相關研究報道，筆者采用析因設計，對兩者之間作用進行了研究，報道如下：

1 材料和方法

1．1 材料1．1．1 酶和試劑 DMEM 培養基、胎牛血清、非必需氨基酸、B-巰基乙醇、丙酮酸鈉購自GIBCO BRL公司，膠原酶IV、胰蛋白酶、透明質酸酶、全反式維甲酸（all transretinoic acid，RA）、噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購自SIGMA公司，Percoll為Pharmacia公司產品，L（＋）谷氨酰胺購自中國醫藥公司；C-KIT受體試劑盒，SCF（stem cell factor）購自Invitrogen公司。

1．1．2 實驗動物 7～8日齡的雄性昆明小白鼠，安徽醫科大學實驗動物中心提供。

1．2 方法

1．2．1 分離純化小鼠精原干細胞 采用一步酶消化法［3］，將離散的生精小管小段用含1%雙抗的PBS漂洗2遍后移入離心管中，加入中性蛋白酶H，37℃消化20～30min，期間不時震蕩離心管或用移液槍反復吹吸；待消化液中出現白色絮狀漂浮物時收集消化液800r／min離心3min，去上清液后用DMEM洗滌1次，用mSSCs培養液重懸；將懸液用200目尼龍篩過濾，收集濾液，將其接種至含小鼠成纖維細胞飼養層的培養皿中。

1．2．2 精原干細胞培養 將細胞懸液接種于96孔培養板中，按照RA濃度（1g／L、2g／L和4g／L）和SCF濃度（20ng／ml、30ng／ml和40ng／ml）全面組合，實驗共分9組，每組設3個重復，置于34℃、5%CO2、100%濕度條件下培養。待24h細胞貼壁后，除對照組外，各組分別加入事先配置好的不同生長因子和維甲酸的培養液。每隔8～12h觀察細胞的存活及分裂增殖情況。在加入生長因子72h后對各組進行MTT檢測。

1．2．3 MTT檢測 0．25%胰蛋白酶消化單層培養細胞，用DMEM培養液制成單細胞懸液，以103～104個每孔的密度接種于96孔培養板中；37℃、5%CO2及100%濕度條件下培養3～5d后，每孔加入MTT溶液（5mg／ml）20uL，37℃孵育4h，終止培養，棄上清。每孔加入150μl DMSO，振蕩10min。選擇490nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔的光吸收值，記錄結果。

1．2．4 增殖的細胞作組織學染色行C-KIT受體鑒定。

1．3 統計學分析 采用SPSS 21．0進行統計分析，計量資料采用（±s）表示，采用析因設計方差分析，檢驗水準取α＝0．05。

2 結果

2．1 培養24h后和72h后C-KIT受體檢測結果

HE染色見增殖的精原干細胞為圓形，細胞大小均勻，胞體較小、核大而圓著色深，胞質淺染、核／質比高；而背景的基質細胞呈梭形，胞質著色相對較淺，見圖1；C-KIT受體顯示培養72h后的精原干細胞膜染成深黃褐色，胞質和細胞核不作色，背景基質細胞為陰性，見圖2。

2．2 析因設計結果

2．2．1 SCF與RA主效應各水平組比較 固定RA因素影響，SCF各組OD值結果見表1；固定SCF影響，RA各組OD值結果見表2，圖形展示見圖3。

表1 SCF不同水平組OD值比較

表2 RA不同水平組OD值比較

2．3．2 兩因素分析結果 SCF與RA各三水平全面組合，共9組，每組設置重復次數為3次，培養72h后，檢測各培養樣品的吸光度（OD）值，獲得結果見表3。采用析因設計的方差分析進行統計學檢驗，方差齊性檢驗，F＝1．801，P＝0．143＞0．05，符合方差齊性。析因設計方差分析，SCF檢驗對應F＝80．508，P＜0．01，RA檢驗結果F＝22．355，P＜0．01，SCF＊RA 交互作用檢驗F＝3．865，P＝0．019＜0．05，具體結果見表4。

圖3 SCF（a）與RA（b）主效應OD值比較

圖4 SCF與RA交互作用圖

表3 SCF與RA9種組合3次重復吸光度值（±s，n＝3）

表3 SCF與RA9種組合3次重復吸光度值（±s，n＝3）

RA（g／L）1 2 4 SCF（ng／ml） 20 0．49±0．05 0．63±0．06 0．57±0．02 30 0．65±0．04 0．72±0．06 0．81±0．05 40 0．75±0．08 0．96±0．02 0．85±0．04

表4 SCF與RA析因設計ANOVA分析結果

3 討論

精子發生是一個以精原干細胞（SSCs）為基礎的復雜而高度有序的過程。精原干細胞具有永生化和多能化潛能，是精子形成的前體細胞，其自我更新和起始分化之間的平衡則是維持個體正常生育能力的關鍵。精原干細胞在睪丸等微環境中具有增殖與分化的能力，其終生擴增能力為雄性精子細胞源源不斷產生所必需，對其增殖調控機制的研究成為研究男性不育途徑之一。

眾多文獻發現在體外培養SSCs中，添加GDNF和 SCF［1］、維生素 A［2］、黃芪注射液［4］、枸杞多糖［5-6］、GDNF和 LIF［7］等，均可以促進精原干細胞的增殖。然而上述研究均在單因素研究的基礎之上，沒有考慮因素之間的交互作用。本研究選擇SCF和VA為研究因素，兩因素各設置3個水平，全面組合分成9組，采用析因設計方法分析兩種因素之間是否存在交互影響。

研究結果發現當固定RA因素，SCF低、中、高三組吸光度值分別為0．563±0．023，0．724±0．016和0．852±0．021，三組之間比較，相互間差異均有統計學意義（P＜0．01）；當固定SCF因素，RA低、中和高三組吸光度值分別為0．626±0．026，0．770±0．019和0．743±0．023，中、高劑量組吸光度值高于低劑量組（P＜0．01），中高劑量組間無差異（P＞0．05）。結果再次證實SCF和RA均具有精原干細胞的體外增值作用。析因設計方差分析發現，SCF與RA之間交互作用分析，F＝3．865，P＝0．019＜0．05，顯示兩種因素之間存在交互影響作用，兩者濃度之間最佳組合為SCF高劑量與RA中劑量組。

SCF是一種作用廣泛的多肽生長因子細胞因子，為c-kit受體的配體［8］。SCF促進小鼠SSCs分裂增殖的機制，可能是由于SCF彌補了體外環境中SCF的不足，SCF與小鼠SSCs膜上的c-k it酪氨酸激酶受體發生特異性結合，誘導該受體自動磷酸化，從而有利于其干細胞狀態的維持和自增殖能力的調節。KIT配體是由支持細胞分泌的，KIT受體則存在于A型精原干細胞上，在B型及初級精母細胞為低水平表達，在精子細胞中不表達，因此C-KIT受體可作為A型精原干細胞的標志物，但該受體并不是精原干細胞特有的標志物，在其它干細胞中也有表達，故也常作為干細胞的一個常見的輔助檢測指標。本研究在飼養層上增殖呈鏈狀、團狀的細胞的胞膜染色為陽性，胞質和胞核為陰性，這不僅提示C-KIT受體可作為檢測精原干細胞的一個重要指標，同時也提示該受體在精原干細胞上是一種膜受體，該受體在體外培養過程中可能與外源性的配體SCF結合發揮調節作用［9］。維生素A參與胚胎的正常發育，并維持機體多種生理活動。目前關于維生素A對人類雄性生殖系統影響的研究尚比較匾乏，通過對嚙齒動物維生素A缺乏或過多癥的研究，表明維生素A對雄性生殖系統的發育和正常維持是必需的［10］。

精原干細胞體外增值影響因素較多，其機制也異常復雜，研究因素往往不是單一作用于受試對象，各因素之間或多或少都會相互影響，傳統的單一因素設計的實驗只能解決單一因素的作用，當其他因素發生變化時，其作用大小甚至方向均可能發生變化。本次研究采用3×3析因設計，研究了SCF與RA之間的交互作用，比以往的單一因素研究在實驗設計上更加科學，然而因為影響SSCs增殖的影響因素很多，要充分研究它們之間的影響，尋求最佳的干預因素的組合，有待采進一步采用更為復雜的多因素實驗設計如正交設計與均勻設計進行研究。

［1］ 畢聰明，王珅，周鐵忠，等．GDNF和SCF促進小鼠精原干細胞增殖與分化的研究［J］．遼寧醫學院學報，2009，03：193-195，289．

［2］ 胡建新，孫兆林，何堅，等．維生素A對體外培養小鼠精原干細胞生長增殖的影響［J］．中國組織工程研究與臨床康復，2010，10：1791-1794．

［3］ 宋銳，曹鴻國，陶勇，等．一種簡便的小鼠精原干細胞分離培養方法［J］．中國細胞生物學學報，2010，02：285-290．

［4］ 余榮嬌，洪燕，劉茜，等．黃芪注射液對大鼠精原干細胞增殖作用的影響［J］．江西中醫學院學報，2010，02：67-69．

［5］ 劉慧蓮．枸杞多糖對小鼠精原干細胞增殖作用的影響［J］．安徽農業科學，2012，03：1490-1492．

［6］ 馬良宏，邱志軍，閆圣男，等．枸杞多糖對精原干細胞體外增殖的影響［J］．中國組織工程研究與臨床康復，2011，23：4277-4281．

［7］ 索麗娟，胡建宏，王鵬，等．GDNF和LIF對小鼠精原干細胞體外增殖的影響［J］．西北農林科技大學學報（自然科學版），2012，04：1-7．

［8］ Copeland NC，Gibert DJ，Cho BC，et al．Mast cell growth factor maps near the steel locus on mouse chromosome 10and is deleted in a number of steel alleles［J］．Cell，1990；63：175-183．

［9］ 徐富翠，吳紹華，郭勇，等．小鼠精原干細胞生物學特征的研究［J］．瀘州醫學院學報，2006，03：191-195．

［10］ Uvera G，Rouiler-Fabre V，Pairalllt C，et al．Regulation and perturbation of testicular functions by vitamin A［J］．Reporduction，2002，124：173-180．