利用復合酶制備低聚甘露糖*

史紅玲，焦鑄錦，唐存多，王瑞，姚倫廣，闞云超，鄔敏辰

1(南陽師范學院，昆蟲生物反應器河南省工程實驗室，河南 南陽，473061)

2(江南大學，無錫醫學院，江蘇無錫，214122)

在過去的20年里，許多類型的低聚糖因有益于人體健康且具有極好的生理活性已受到廣泛的關注［1］。其中，低聚半乳糖、低聚果糖、低聚木糖和低聚異麥芽糖等都已被工業化生產［1］，而低聚甘露糖受到的關注仍然較少。低聚甘露糖 (Mannooligosaccharide，MOS)是由 2～10個D-甘露糖通過 β-1，4糖苷鍵聚合而成的低聚糖，又稱甘露寡糖［2］。作為食品或者飼料添加劑使用，可有效促進生物體內以雙歧桿菌為代表的腸道益生菌群的特異性增殖［3］，并具有抑制體內病原菌生長［4］，減少有毒代謝產物的生成，防止便秘，保護肝臟，抗腫瘤及增強機體免疫力等多種生理功能，并且具有低熱值、低甜度、不引發齲齒［5］、不增加血糖濃度等特點，是新一代的功能性食品［6］。魔芋的主要成分為魔芋葡甘露聚糖(konjak glucomannan，KGM)［7］。魔芋葡甘露聚糖主要由甘露糖和葡萄糖組成，其摩爾比為1.5∶1。已有研究表明，它可以被β-1，4-內切葡聚糖酶和β-甘露聚糖酶水解［8］。我國魔芋資源豐富，目前主要作為一種粗纖維糧食或食品添加劑使用，附加值比較低［9］。將魔芋粉水解得到高附加值的MOS，可獲得較大的經濟效益［10］。目前，低聚甘露糖的生產方法主要包括從天然原料中提取、化學降解及生物降解［11］。前兩種方法的后期處理較為復雜，且借助酸堿水解的化學法成本高且對環境的污染大。生物降解的過程無毒且安全，反應條件溫和，能耗低，節約資源且保護環境［12］，是生產 MOS 最理想的方法［13］。陶興無［14］、徐春梅［9］、Kurakake［15］、Albrecht［2］等人都有關于酶法生產低聚甘露糖的研究報道。而酶法生產低聚甘露糖主要受制于所用的關鍵酶的催化效率較低、酶的生產和使用成本較高，以及底物黏度過大難以實現高濃度的生產［16］。因此，若要實現酶法制備低聚甘露糖的工業化生產，必須在水解KGM的關鍵酶的研究方面取得突破性進展。

前期的研究中，已經明確了β-甘露聚糖酶和β-1，4-內切葡聚糖酶對魔芋精粉的水解具有顯著的協同作用這一現象。此外，我們已獲得了催化活性較高、熱穩定性好的重組β-甘露聚糖酶reAuMan5AN3C3，同時在之前的研究中也克隆了宇佐美曲霉β-1，4-內切葡聚糖酶基因并在畢赤酵母中實現了異源表達，獲得了重組 β-1，4-內切葡聚糖酶 reAuCel12A［17］。本論文在前期的研究基礎上，主要研究β-甘露聚糖酶和β-1，4-內切葡聚糖酶協同水解魔芋精粉制備低聚甘露糖的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設備

50 mm×100 mm“海洋”牌硅膠板，青島海洋化工分廠，用于薄層層析分析;恒溫水浴搖床，江蘇太倉市實驗設備廠;可調微量移液器，Eppendorf公司;DELTA320 pH計，Mettler Toledo公司;AB1104-N電子分析天平，Mettler Toledo公司;722可見光分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司;超凈工作臺，Thermo Forma公司;THZ恒溫振蕩器，江蘇太倉市實驗設備廠;TG16-WS臺式高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.2 主要試劑

重組β-甘露聚糖酶 (reAuMan5AN3C3)和重組β-1，4-內切葡聚糖酶 (reAuCel12A)由本研究室制備;魔芋精粉購自武漢市清江魔芋制品有限公司;展開劑，用丁醇、冰醋酸和水按2∶1∶1的比例配制;顯色劑，由0.4 mL苯胺、0.4 g二苯胺和2 mL 85%濃磷酸溶于20 mL丙酮配制而成;β-1，4-D-低聚甘露糖標準品購自上海西寶生物科技有限公司;其他試劑均為國產或進口分析純。

1.3 魔芋精粉中糖含量的分析

采用改進的DNS法測定樣品的β-甘露聚糖酶活性及β-1，4-內切葡聚糖酶活性。取2.4 mL 0.5%角豆膠溶液(pH 3.6)加入0.1 mL適當稀釋的β-甘露聚糖酶液，60℃下反應10 min，加入2.5 mL DNS試劑，沸水浴中顯色7 min，測定OD540。在上述反應條件下，每分鐘產生1 μmol還原糖(以甘露糖計)所需的酶量定義為1個酶活性單位(U)。用類似的方法，以羧甲基纖維素鈉(pH 5.0)為底物、葡萄糖為標準品測定β-1，4-內切葡聚糖酶的活性。

1.4 魔芋精粉中糖含量的分析

1.4.1 魔芋精粉中KGM總糖含量的測定

該總糖僅指KGM粗提液被酸完全水解后所有還原糖之和(本論文中所有還原糖均以甘露糖計)。準確稱取0.2 g魔芋精粉緩慢加入80 mL去離子水，充分攪拌于35℃溶脹4 h，5 000 r/min離心20 min，上清液即為KGM粗提液，將上清液定容至100 mL。準確吸取4 mL粗提液于25 mL的具塞試管中，加入0.5 mL 6 mol/L的H2SO4，充分混勻，于沸水浴中密閉水解1.5 h后用NaOH中和并定容至10 mL，取上清液1 mL用DNS法測定還原糖的量并計算出魔芋精粉中KGM的總糖含量。魔芋精粉中KGM總糖質量分數的計算公式為:

1.4.2 魔芋精粉游離還原糖含量的測定

準確吸取上述KGM粗提液2.5 mL，用DNS法測定粗提液中還原糖的量并計算出魔芋精粉中游離還原糖的總量。計算公式為:

KGM質量分數的計算公式為:

其中0.9為換算系數。換算系數為KGM中葡萄糖和甘露糖殘基分子量與KGM水解生成葡萄糖和甘露糖的分子量之比值。

1.5 水解率及平均聚合度的測定及計算

魔芋精粉水解率是指水解釋放出的還原糖與魔芋精粉總糖量的比值。計算公式為:

水解率是反映聚合物水解程度的一個指標，水解率越高表明水解越徹底，當制備魔芋低聚甘露糖時，該數值一般應達到60%以上［16］。

平均聚合度(DP)是魔芋膠總糖量與酶解液還原糖量的比值，它越接近于1說明魔芋膠水解越徹底，工業化生產低聚甘露糖所需的平均聚合度一般應控制在1.8～1.9。

1.6 魔芋精粉復合酶法水解條件的研究

影響魔芋精粉復合酶法水解的因素主要有不同酶的配比、酶解pH、酶解時間、酶解溫度和底物濃度［9］。在本研究中首先研究不同比例的β-甘露聚糖酶與β-1，4-內切葡聚糖酶對魔芋精粉水解率的影響，獲得最佳的復合酶的配比，然后再對其他4個因素進行單因素實驗，單因素實驗中除了被研究的因素之外其他3個因素均保持不變，且均將上一研究獲得的最佳條件固定用于下一研究。

1.7 魔芋精粉水解產物的定性分析

本研究以“海洋”牌硅膠板為層析載體，采用2∶1∶1的丁醇、冰醋酸和水的混合液作為展層劑，0.4 mL苯胺、0.4 g二苯胺和2 mL 85%濃磷酸溶于20 mL丙酮的混合液為顯色劑對魔芋精粉水解產物進行薄層層析定性分析。由于樣品中低聚糖的濃度較低，因此每個樣品需點5次，展層5 h后，將硅膠板放置在通風櫥中，通風30 min，待展層劑完全揮發掉后用噴壺噴灑顯色劑，于室溫晾20 min，再于105℃烘3～5 min，最后拍照觀察。

1.8 復合酶的穩定性實驗

將加有保護劑(4%蛋白胨、5%淀粉、0.4%山梨酸鉀和10%木糖醇)的復合酶與沒有添加保護劑的復合酶同時于室溫保藏6個月，期間每1個月測定1次復合酶中各組分的殘留酶活，計算酶活殘留率:

2 結果與討論

2.1 魔芋精粉中糖含量的測定

按照1.4中所述的方法及公式測定并計算出魔芋精粉中總糖、游離還原糖及魔芋葡甘露聚糖(KGM)的質量分數，8次平行測定的結果如表1所示。

表1 魔芋精粉中總糖、游離還原糖及KGM的質量分數Table 1 The mass fractions of total sugar，free reducing sugar and KGM in konjac powder

由表1可知魔芋精粉中總糖的質量分數為69.3%，游離還原糖的質量分數為3.1%，KGM的質量分數為59.5%，測得的含量略低于徐春梅等人報道的含量［9］，這可能與溶脹魔芋精粉所用的緩沖液有關。在本研究中為了減少酸堿的用量，直接使用去離子水溶脹魔芋精粉，而徐春梅等人使用甲酸-氫氧化鈉緩沖液進行溶脹，她所使用的緩沖液可能更有利于魔芋精粉中KGM的釋出。

2.2 魔芋精粉復合酶法水解的工藝研究

2.2.1 不同配比的復合酶對魔芋精粉水解率的影響

以用去離子水配制的20 g/L魔芋膠溶液為底物，60 U/g魔芋精粉的reAuMan5AN3C3并輔以不同單位酶活性的β-1，4-內切葡聚糖酶在50℃水解4 h，然后用DNS法測定水解產物中還原糖的含量并計算出魔芋精粉的水解率，研究復合酶酶活性的不同配比對魔芋精粉水解率的影響，結果如表2所示。由表2可以看出，β-1，4-內切葡聚糖酶可以明顯地促進reAu-Man5AN3C3對魔芋精粉的水解，大大地提高了魔芋精粉的水解率，水解率最高可達52.8%;而且復合酶的水解率明顯高于各個單一酶的水解率之和，這也說明兩種酶對魔芋精粉的水解具有較好的協同作用。當reAuMan5AN3C3和reAuCel12A的比例達到1∶1.5時，若再增加reAuCel12A的比例，協同作用也已不會再有顯著的提高，因此reAuMan5AN3C3和reAuCel12A的比例為1∶1.5為宜。

表2 β-1，4-內切葡聚糖酶對魔芋精粉水解率的影響Table 2 The effects of the β-endo-glucanase on the hydrolytic rate of konjak gum

2.2.2 酶解pH值對魔芋精粉水解率的影響

將reAuMan5AN3C3和 reAuCel12A 按1∶1.5的比例添加(前者為60 U/g魔芋精粉)，50℃下將用去離子水及不同pH值(2.5～6)緩沖液配制的20 g/L魔芋膠溶液水解4 h，然后用DNS法測定水解產物中還原糖的含量并計算出魔芋精粉的水解率，研究不同pH值對魔芋精粉水解率的影響，結果如圖1所示。

圖1 酶解pH值對魔芋精粉水解率的影響Fig.1 Effects of pH values on the hydrolytic rate of konjak gum

結果顯示，在測定范圍內，酶解pH值對魔芋精粉的水解率影響不明顯，在3.0和5.0時分別出現1個峰值，這可能歸因于復合酶中1個酶的最適pH值為3.0，另1個的最適pH值為5.0。另外，以去離子水構建反應體系時，魔芋精粉的水解率也較高?？紤]到緩沖液會向反應體系帶入許多離子，不利于后續產品的精制，且會增加生產成本［9］，因此在后續的研究中均采用去離子水溶解魔芋精粉進行低聚甘露糖的酶法制備研究。

2.2.3 酶解時間對魔芋精粉水解率的影響

以去離子水構建反應體系在50℃條件下，用reAuMan5AN3C3和reAuCel12A配比為1∶1.5的復合酶(前者為60 U/g魔芋精粉)將20 g/L的魔芋膠溶液水解不同的時間(1～10 h)，然后用DNS法測定水解產物中還原糖的含量并計算出魔芋精粉的水解率，研究不同酶解時間對魔芋精粉水解率的影響，結果如圖2所示。由圖2所知，隨著酶解時間的延長，魔芋精粉的水解率逐漸增加，當酶解時間達到6 h時，水解率的增加趨于平緩，且水解6 h與水解8 h的水解率差異不明顯?？紤]到較短的生產周期可以提高生產效率及設備的利用率，同時可以降低染菌的風險，故選擇酶解6 h進行低聚甘露糖的酶法制備研究為宜。

圖2 酶解時間對魔芋精粉水解率的影響Fig.2 Effects of the hydrolysis time on the hydrolytic rate of konjak gum

2.2.4 酶解溫度對魔芋精粉水解率的影響

以去離子水構建反應體系在不同溫度下(20～70℃)，用 reAuMan5AN3C3和 reAuCel12A配比為1∶1.5的復合酶(前者為60 U/g魔芋精粉)將20 g/L的魔芋膠溶液水解6 h，然后用DNS法測定水解產物中還原糖的含量并計算出魔芋精粉的水解率，研究不同酶解溫度對魔芋精粉水解率的影響，結果如圖3所示。結果顯示，在常溫下魔芋精粉的水解率較低;而當水解溫度為60℃時，魔芋精粉的水解率最高可達66.5%;當溫度為70℃時，魔芋精粉的水解率有所降低，這些結果與復合酶的熱穩定性存在一定的關系。reAuMan5AN3C3所能耐受的溫度為 70℃，但 reAu-Cel12A所能耐受的溫度僅為50℃，所以水解溫度超過60℃后水解率反而下降，故選擇60℃的溫度進行低聚甘露糖的酶法制備研究為宜。

圖3 酶解溫度對魔芋精粉水解率的影響Fig.3 Effects of the hydrolysis temperature on the hydrolytic rate of konjak gum

2.2.5 底物濃度對魔芋精粉水解率的影響

一般來說，在酶促反應中酶能耐受的底物濃度越高，酶的催化效率就越高，同時所得的產物濃度也會越高，會更利于后續產物的精制。然而受限于魔芋膠本身高粘度的特性，很難獲得高濃度的底物，而且過高濃度的底物黏度也過大，也不利于酶與底物的相互作用。本研究中選取用去離子水配制的不同濃度魔芋膠溶液(5～40 g/L)作為研究對象，分別用reAu-Man5AN3C3和reAuCel12A配比為1∶1.5的復合酶(前者為60 U/g魔芋精粉)在60℃下水解6 h，然后用DNS法測定水解產物中還原糖的含量并計算出魔芋精粉的水解率，研究不同底物濃度對魔芋精粉水解率的影響，結果如圖4所示。

圖4 底物濃度對魔芋精粉水解率的影響Fig.4 Effects of the substrate concentration on the hydrolytic rate of konjak gum

結果顯示，在底物質量濃度為5～30 g/L時，魔芋精粉的水解率變化不大，基本能維持在66%左右;當底物濃度超過30 g/L時，魔芋精粉的水解率有明顯的下降。這主要是在較低的底物濃度范圍內時底物的黏度較低，對酶解反應的阻礙作用還不太明顯;而隨著底物濃度的增大，其黏度也在不斷增大，這極大地阻礙了重組酶對底物的充分水解，不利于可溶性還原糖的釋放，會明顯降低魔芋精粉的水解率。因此，綜上所述故選擇30 g/L的魔芋膠溶液進行低聚甘露糖的酶法制備研究為宜。

2.2.6 水解產物的定性分析

為了研究魔芋精粉被復合酶水解后各種低聚糖的分布情況，采用1.6中的方法對其水解產物進行薄層層析分析，結果如圖5所示。結果顯示未被水解的魔芋膠溶液的遷移率較低，幾乎都集中在點樣處附近;而經復合酶酶水解后的產物主要為二糖以上的寡糖，且主要介于二糖與六糖之間，沒有檢測到單糖的產生，這與所用的酶均為內切酶有關［18］;另外，隨著β-1，4-內切葡聚糖酶的加入，水解產物在點樣處附近的拖尾現象明顯減弱，這也說明加入β-1，4-內切葡聚糖酶后魔芋精粉的水解更加充分，與其水解率的測定結果一致。

圖5 水解產物的薄層層析分析Fig.5 The thin layer chromatography analysis of hydrolysis products from konjak gum

2.2.7 復合酶的穩定性研究

按照1.7中所述的保藏方法，測得添加保護劑的復合酶與沒有添加保護劑的復合酶的酶活殘留率結果如表3所示。由此可見，在各個時間段內，添加了保護劑的復合酶的酶活殘留率均明顯高于未添加保護劑的復合酶，且添加了保護劑的復合酶在2個月之內，復合酶的各個酶活性均保持在85%以上。我們可以根據此實驗結果確定實際生產中復合酶的保存時間。

3 結論

復合酶酶解魔芋精粉制備低聚甘露糖的工藝條件為:用去離子水配制的30 g/L魔芋膠溶液，reAu-Man5AN3C3和reAuCel12A配比為1∶1.5(前者為60 U/g魔芋精粉)，水解溫度為60℃，水解時間為6 h，在此條件下魔芋精粉的水解率可達65%，已超過了60%的標準，達到了工業生產的要求。穩定性的研究結果也表明，保護劑對復合酶的穩定性有明顯地促進作用。兩種酶的協同使用可以顯著地提高對方的催化效率，能夠大大降低酶的使用成本，本研究為酶法制備低聚甘露的工業化生產奠定了堅實的基礎。

表3 添加保護劑與不添加保護劑復合酶的酶活殘留率Table 3 Remained enzyme activity of complex enzyme with stabilizer or not

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