固定化葡萄糖異構酶的微波活化及其性質研究*

張甫生，胡國洲，田美玲，李曼珊，闞建全

(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)

葡萄糖異構酶(Glucose isomerase，簡稱 GI)，能將D-木糖、D-葡萄糖、D-核糖等醛糖轉化為相應的酮糖，是工業上大規模制備果葡糖漿的關鍵轉化酶［1-2］。因果葡糖漿具有溶解度高、保濕性好、抗結晶性好及風味濃郁等特點，現作為甜味劑已逐步取代了蔗糖的地位［3-4］。隨著果葡糖漿使用量增長，國內外市場上對葡萄糖異構酶的需求也在不斷增加;然而葡萄糖異構酶在應用過程中存在酶活性低、再生困難、壽命短及價格昂貴等問題，極大地限制了其工業化應用，也增加了實際生產成本，成為制約果葡糖漿產業發展的瓶頸問題。為此，國內外企業及研究機構都迫切地期望通過酶改性技術，達到提高酶活、延長酶壽命、降低生產用酶量的目的。

近年來，微波處理等作為食品工業殺菌與鈍酶的加工手段漸入人們視野［5-6］。在應用微波對酶進行處理的過程中發現，一些較低強度的微波處理能迅速地提高酶的活性，如Yu等對微波活化脂肪酶進行研究，發現與普通加熱相比，480 W的微波處理可使諾維信脂肪酶活性提高1.5倍［7］;Lukasiewicz等研究顯示，微波處理可使γ-淀粉酶的初始反應速率最大可提高2.5倍［8］;Roy等研究表明微波的非熱效應可使蛋白酶初始反應速率提高2.1～4.7倍，同時與pH及鹽離子等還有協同增效的作用［9］。此外，微波處理還可以使纖維素酶［10］、S-腺苷高半胱氨酸水解酶［11］、α-半乳糖苷酶［12］及 β-葡糖苷酶［12］等酶的活性增強。這就顯示在適當條件下微波處理對食品中酶具有活化效果，可以對酶進行活化改性，來提高酶活。但上述這些激活研究大多集中于對單一游離酶活性提高方面，未進一步涉及其酶學性質等方面變化。

在微波處理對葡萄糖異構酶活化方面，除本團隊前期報道微波處理激活游離葡萄糖異構酶［13］外，目前尚未見其他相關的研究報道。因酶在經過固定化之后，固定化酶的活性中心、空間結構和電荷狀態等發生改變［2，4］，微波處理對固定化后葡萄糖異構酶的影響也定會有所改變。因此，本文以固定化葡萄糖異構酶為研究對象，探討微波處理對其活性及相關酶學性質的影響，以期為微波處理對固定化酶活化改性提供理論基礎，并推動微波處理等非熱加工技術在酶改性領域中的合理應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄糖異構酶(≥10萬U/g)，武漢銀河化工有限公司;固定化葡萄糖異構酶，以活化硅膠為載體自制(酶活125 U/g)。

咔唑、半胱氨酸鹽酸鹽、葡萄糖、Na2HPO4、NaH2PO4、果糖、H2SO4、高氯酸、MgSO4、CoCl2等均為分析純，成都科龍試劑有限公司;硅膠(300目)，青島海洋化工廠分廠。

1.2 設備與儀器

MAS-Ⅱ型微波快速制樣系統(工作功率0～1 000 W，工作溫度25～250℃)，上海新儀公司;UV-2450型紫外分光光度計，日本島津公司;PB-10精密pH計，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;FA2004型電子天平，上海精科天平;SHZ-82A恒溫水浴振蕩器，江蘇金壇市恒豐儀器制造有限公司;DK-8D型三孔電熱恒溫水槽，上海齊欣科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 固定化葡萄糖異構酶的制備

取5 mg/mL葡萄糖異構酶酶液30 mL，加入1 g干燥活化硅膠(硅膠活化參考 Song的方法［14］)，于25℃水浴振蕩器(170 r/min)中振蕩24 h，然后用去離子水充分洗滌，抽濾得到固定化葡萄糖異構酶樣品，于4℃保存備用。

1.3.2 固定化葡萄糖異構酶酶活力測定

采用半胱氨酸-咔唑法［3］。反應體系為:0.2 mol/L pH7.0磷酸緩沖液10 mL，2 mol/L的葡萄糖混合溶液10 mL(含有0.05 mol/L Mg2+和0.01 mol/L Co2+，下同)，0.4 g固定化酶?；旌弦褐糜?0℃水浴中，反應30 min后，迅速加入0.5 mol/L的高氯酸溶液2.5 mL終止反應，后用半胱氨酸-咔唑法測定果糖含量，根據果糖標準曲線計算固定化葡萄糖異構酶的酶活力。固定化酶酶活力單位定義:在該反應條件下，1 g固定化酶每分鐘將1 μmol葡萄糖異構為果糖的微摩爾數為1個活力單位(U/g)。

1.3.3 微波處理對固定化葡萄糖異構酶活性增強的影響

以10 mL 2%固定化酶+10 mL 2 mol/L的葡萄糖底物混合溶液為待處理液(均以pH 7.0緩沖液配制，下同)，以水浴加熱處理為對照，并以其酶活為100%，在微波處理溫度70℃和處理時間30 min的條件下，探討不同功率(200、300、400、600、800 W)微波處理對葡萄糖異構酶活性增強的影響。

1.3.4 微波處理對固定化葡萄糖異構酶的最適反應溫度的影響

在固定微波處理功率400 W和處理時間30 min的條件下，探討不同微波處理溫度(55、65、70、75、80、85、90℃)對固定化葡萄糖異構酶活性的影響，以最大酶活力為100%，分析其最適反應溫度。

1.3.5 微波處理對固定化葡萄糖異構酶的最適pH的影響

在固定微波處理功率400 W、處理溫度70℃和處理時間30 min的條件下，探討不同pH(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0)對固定化葡萄糖異構酶活性的影響，以最大酶活力為100%，分析其最適反應pH。

1.3.6 微波處理對固定化葡萄糖異構酶的Km值與Vmax的影響

以10 mL 2%固定化酶+10 mL一系列濃度(100、300、500、800、1 000、1 500 mmol/L)的葡萄糖底物混合溶液為待處理液，以水浴加熱處理為對照，在固定微波處理功率400 W、處理溫度70℃和處理時間30 min的條件下進行微波處理，測定固定化酶活性。根據經典的Michaelis-Menten動力學方程，運用Lineweaver-Burk作圖［3］(雙倒數法)得到米氏方程，進而利用米氏方程計算微波加熱處理條件下葡萄糖異構酶的Km和Vmax。

1.3.7 金屬離子濃度對微波處理固定化葡萄糖異構酶活性的影響

在固定微波處理功率400 W、處理溫度70℃和處理時間30 min的條件下，探討底物溶液中不同Mg2+濃度(0、0.001、0.01、0.05、0.08、0.1 mol/L)和Co2+濃度(0、0.001、0.001、0.002、0.005、0.01 mol/L)對固定化葡萄糖異構酶活性的影響，以水浴對照初始酶活力為100%，比較分析底物中最適Mg2+和Co2+濃度。

1.3.8 微波處理固定化葡萄糖異構酶的穩定性分析

(1)固定化葡萄糖異構酶的熱穩定性分析

在固定微波處理功率400 W，處理溫度為30～90℃條件下保溫處理酶液1 h，冷卻到4℃后，測定固定化酶酶活，以最大酶活力為100%。分析比較微波加熱處理和水浴加熱對照處理下固定化葡萄糖異構酶的熱穩定性。

(2)固定化葡萄糖異構酶的操作穩定性分析

在固定微波處理功率400 W、處理溫度70℃和處理時間30 min的條件下進行微波處理，測定固定化酶活性。而后將固定化酶收集，用去離子水洗滌干凈，置于4℃冰箱保存4 h后，再用同樣的方法進行微波加熱處理并測定其活性。重復試驗15次，以初始酶活力為100%，比較固定化酶在微波加熱和水浴加熱條件下酶的操作穩定性。

1.4 數據分析

每組試驗均重復3次，試驗數據運用OriginPro 8.0和Excel 2010進行分析處理和圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 微波處理對固定化葡萄糖異構酶活性增強的影響

由圖1可知，固定化葡萄糖異構酶活性在不同功率微波處理后，酶活力均有所提高，說明固定化葡萄糖異構酶在微波處理的條件下均被活化;但酶活力增幅呈現先增加后降低的趨勢，微波功率為200～400 W時，固定化葡萄糖異構酶活性上升，并在400 W時達到最高為156.1 U/g，比對照水浴處理酶活(125.4 U/g)增加了24.5%;而當微波功率增至600 W、800 W時，固定化酶酶活增幅降低，與對照相比酶活分別僅增加18.0%和15.5%。這可能是因為適當的微波處理功率使酶中某些與酶活力相關的功能基團發生有序重排，從而使酶活力提高，而過高的處理功率使酶蛋白部分變性，進而導致酶活性降低或增幅降低［7］。

圖1 微波處理對固定化葡萄糖異構酶活性增強的影響Fig.1 Effect of microwave treatment on enhancing activity of immobilized glucose isomerase

2.2 微波處理對固定化葡萄糖異構酶最適反應溫度的影響

溫度是影響葡萄糖異構酶活性的一個重要因素，在適宜的溫度范圍內，葡萄糖異構酶比較穩定，當偏離最適溫度后，酶就會發生熱變性而導致失活［15］。微波處理對固定化葡萄糖異構酶最適溫度的影響見圖2。

圖2 微波處理對固定化葡萄糖異構酶最適反應溫度的影響Fig.2 Effect of microwave treatment on optimal temperature of immobilized glucose isomerase

從圖2可以看出，微波處理與水浴對照處理固定化葡萄糖異構酶的最適反應溫度分別為75℃和80℃;與水浴對照相比，在微波處理下固定化酶的最適反應溫度降低了5℃，且其最適溫度范圍(酶活＞95%的溫度范圍)變小，水浴處理的固定化葡萄糖異構酶最適溫度范圍為75～85℃，而微波處理后固定化葡萄糖異構酶最適溫度范圍為75～80℃;這與前期游離酶的研究結果［13］正好相反，這可能與載體對固定化酶蛋白的保護作用有關，載體對酶蛋白分子構象完整性自動進行調整［1-2］，阻礙了微波處理對酶結構的有序重排或加速無序結構，從而使最適反應溫度與最適溫度范圍降低。而同時在較高的反應溫度范圍(80～90℃)內，微波處理固定化酶的活力比對照處理下降較快，可能是在高溫條件下，微波處理更易使部分固定化葡萄糖異構酶失活所致［16］。

2.3 微波處理對固定化葡萄糖異構酶最適pH的影響

pH能影響酶分子活性部位上酸性或堿性氨基酸側基的解離狀態，從而影響酶活性中心與底物的結合或催化，進而影響酶活性［17］;pH是影響酶活性的重要因素之一，當介質的pH值對最適宜值偏離較大時，還可導致酶的變性失活。由圖3可以看出，微波處理并未改變固定化葡萄異構酶的最適pH范圍，微波處理和水浴處理的固定化葡萄異構酶的最適pH范圍均為7.0～7.5，且均在pH7時酶活力最高。

圖3 微波處理對固定化葡萄糖異構酶最適pH的影響Fig.3 Effect of microwave treatment on optimal pH of immobilized glucose isomerase

2.4 金屬離子濃度對微波處理固定化葡萄糖異構酶活性的影響

葡萄糖異構酶為金屬離子依賴性酶，其活性中心有Mg2+、Co2+的結合位點，在適宜的Mg2+、Co2+濃度條件下，葡萄糖異構酶分子具有最佳的穩定構象和最高的活性［4］。不同金屬離子濃度對固定化葡萄糖異構酶的影響，見圖4(a)與4(b)。

從圖4(a)與4(b)中可以看出，固定化葡萄糖異構酶的活性均隨Mg2+與Co2+濃度增加，呈現先增加后穩定的趨勢。對于Mg2+而言，微波處理與水浴對照處理的固定化葡萄糖異構酶的活性在Mg2+濃度為0.001～0.05 mol/L時，活性隨Mg2+濃度增加而增加，濃度大于0.05 mol/L，酶活性趨于穩定;對于Co2+而言，固定化葡萄糖異構酶的活性在Co2+濃度為0～0.001 mol/L時，活性隨Co2+濃度的增加而增加;濃度大于0.001 mol/L時，酶活性趨于穩定。因此，微波處理與水浴對照處理的最適Mg2+與Co2+濃度分別為0.05 mol/L和0.001 mol/L。此外，從圖4(a)與4(b)中也可以看出，微波處理固定化酶的活性均較水浴對照處理高，這與2.1結果一致，再次證明微波處理對固定化葡萄糖異構酶有活化作用。

圖4 Mg2+(a)和Co2+(b)濃度對微波處理固定化葡萄糖異構酶活性的影響Fig.4 Effect of Mg2+(a)and Co2+(b)on the activity of immobilized glucose isomerase treated by microwave

2.5 微波處理對固定化葡萄糖異構酶的動力學參數影響

由經典的Michaelis-Menten動力學方程，作圖法可得到米氏常數(Km)、最大反應速率(Vmax)。經作圖(圖5a與5b)與計算得出，微波處理下固定化葡萄糖異構酶的Km為0.181 mol/L，Vmax為 8.1 ×10-4mol/(L·min);水浴對照處理固定化酶的Km為0.223 mol/L，Vmax為7.7×10-4mol/(L·min)。說明經微波處理的固定化葡萄糖異構酶與水浴對照處理的相比Vmax增大，Km降低，說明此時酶與底物親和力增大，其在飽和濃度下的限制反應速度也增大。這可能是由于微波處理導致酶結構變化，使酶的底物的親和力增加，葡萄糖異構酶與底物結合更容易，從而表現較高的催化能力［9，18］。

圖5 微波處理(a)和水浴處理(b)固定化葡萄糖異構酶的動力學方程圖Fig.5 Michaelis-Menten kinetics equation of immobilized glucose isomerase treated by microwave(a)and conventional heating(b)

2.6 微波處理固定化葡萄糖異構酶的穩定性分析

(1)固定化葡萄糖異構酶的熱穩定性分析

溫度它不僅可以影響酶蛋白的構象、參與酶促反應官能團的解離狀態，而且還會影響到酶與底物的親和力，酶-底物絡合物的分解，甚至還會影響到酶與激活劑的親和力等，且與pH值等相比，在加工過程更不易控制［19］。固定化酶的熱穩定性是其在工業化應用中最重要的性質之一。固定化酶熱穩定性比較分析見圖6，從圖6可以看出，微波加熱條件下，固定化酶在70℃以下時，其殘余酶活也都是保持在80%以上，呈持續上升狀態;而當溫度大于70℃后，固定化酶的殘余酶活急劇下降，在90℃下降到55.54%;而在水浴加熱對照條件下，固定化酶在80℃以下時，其殘余酶活都是保持在80%以上，也呈持續上升狀態，當溫度大于80℃后，固定化酶活力也開始迅速下降，在90℃下降到81.44%。說明在較低溫度 (微波處理＜70℃，水浴處理＜80℃)時，固定化酶的穩定性較好;而在較高溫度下(微波處理＞70℃，水浴處理＞80℃)時，固定化酶活穩定性不高且酶活開始急劇下降;而在更高溫度90℃時，微波加熱固定化酶活比對照水浴處理下降得更多，穩定性顯著低于對照處理固定化酶活，說明高溫微波加熱對固定化葡萄糖異構酶的穩定性有顯著的影響，這可能是由于在高溫下微波促進了酶從載體脫落減少了載體保護作用或微波其他非熱效應所導致［11，16］?？傮w說來，雖然微波處理顯著地降低了固定化葡萄糖異構酶在高溫中的穩定性，但在＜70℃時固定化葡萄糖異構酶的熱穩定性表現良好且在一定范圍內優于水浴對照處理。

圖6 固定化葡萄糖異構酶在微波處理下的熱穩定性分析Fig.6 Thermal stability of immobilized glucose isomerase treated by microwave

(2)固定化葡萄糖異構酶的操作穩定性分析

固定化酶的操作穩定性也是其在工業化應用中最重要的性質之一［20］。固定化葡萄糖異構酶的操作穩定性分析結果見圖7。

圖7 固定化葡萄糖異構酶在微波處理下的操作穩定性分析Fig.7 Operating stability of immobilized glucose isomerase treated by microwave

從圖7可以看出，固定化酶在使用次數較少時，表現出的較好的穩定性;在使用6次前，微波加熱處理與水浴對照處理的酶活均保持在80%以上，在第6次使用時，兩種處理酶活分別為85.66%和91.35%。但隨著使用次數的增多，相對酶活緩慢地下降，在使用7次到15次之間時，酶活基本呈線性下降的趨勢，在使用15次后，兩種處理酶活分別為30.38%和41.66%。從總體上的變化趨勢來看，微波處理并未顯示改變固定化酶的操作穩定性;后期隨著使用次數增多(＞10次)，微波處理固定化酶操作穩定性降低、酶活損失較大，這可能是由于多次微波處理易導致酶變性引起的［21］?？偟谜f來，微波處理的固定化葡萄糖異構酶仍具有較好的操作穩定性，也能夠滿足實際生產需求，但比水浴加熱條件下操作穩定性要略差些。

3 結論

不同微波功率對固定化葡萄糖異構酶的活性增強程度不同，與水浴對照相比，在最佳微波處理條件下，酶固定化葡萄糖異構酶活性可增加24.50%，說明適宜微波處理用于激活酶是可行的。在此活化過程中，微波處理降低固定化葡萄糖異構酶Km，增大Vmax，但對其最適 pH和最適金屬離子濃度幾乎沒有影響;同時微波處理在一定程度上降低了固定化葡萄糖異構酶的最適反應溫度、最適反應溫度范圍及高溫的熱穩定性、操作穩定性，但這些參數依舊較為理想，能夠滿足實際生產需求。

［1］ YU H，GUO Y，WU D，et al.Immobilization of glucose isomerase onto GAMM support for isomerization of glucose to fructose［J］.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2011，72(1-2):73-76.

［2］ GE Y，ZHOU H，KONG W，et al.Immobilization of glucose isomerase and its application in continuous production of high fructose syrup［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，1998，69(3):203-215.

［3］ Tukel S S，Alagoz D.Catalytic efficiency of immobilized glucose isomerase in isomerization of glucose to fructose［J］.Food Chemistry，2008，111(3):658-662.

［4］ Bhosale S H，Rao M B，Deshpande V V.Molecular and industrial aspects of glucose isomerase［J］.Microbiological Reviews，1996，60(2):280-300.

［5］ 張甫生，李蕾，陳芳，等.非熱加工在鮮切果蔬安全品質控制中應用［J］.食品科學，2011，32(9):329-335.

［6］ Rawson A，Patras A，Tiwari B K，et al.Effect of thermal and non thermal processing technologies on the bioactive content of exotic fruits and their products:Review of recent advances［J］.Food Research International，2011，44(7):1 875-1 887.

［7］ YU D，WANG C，YIN Y，et al.A synergistic effect of microwave irradiation and ionic liquids on enzyme-catalyzed biodiesel production ［J］.Green Chemistry，2011，13(7):1 869-1 875.

［8］ Lukasiewicz M，Marciniak M，Osowiec A.Microwave-assisted enzymatic hydrolysis of starch［C］.Lugo:13th International Electronic Conference on Synthetic Organic Chemistry(ECSOC-13)，2009-11-30.

［9］ Roy I，Gupta M N.Non-thermal effects of microwaves on protease-catalyzed esterification and transesterification［J］.Tetrahedron，2003，59(29):5 431-5 436.

［10］ Nomanbhay S M，Hussain R，Palanisamy K.Microwave-assisted alkaline pretreatment and microwave assisted enzymatic saccharification of oil palm empty fruit bunch fiber for enhanced fermentable sugar yield［J］.Journal of Sustainable Bioenergy Systems，2013，3(1):7-17.

［11］ Porcelli M，Cacciapuoti G，Fusco S.Non-thermal effects of microwaves on proteins:thermophilic enzymes as model system［J］.FEBS Letters，1997，402(2):102-106.

［12］ Young D D，Nichols J，Kelly R M，t al.Microwave activation of enzymatic catalysis［J］.Journal of the American Chemical Society，2008，130(31):10 048-10 049.

［13］ 胡國洲，張甫生，胡鵬，等.微波處理對葡萄糖異構酶性質的影響［J］.食品科學，2014，35(3):134-138.

［14］ SONG Y，Kim J，Park C，et al.Enhancement of glucose isomerase activity by pretreatment with substrates prior to immobilization［J］.Korean Journal of Chemical Engineering，2011，28(4):1 096-1 100.

［15］ Bandish R K，Hess J M，Epting K L，et al.Glucose-tofructose conversion at high temperatures with xylose(glucose)isomerases from Streptomyces murinus and two hyperthermophilic Thermotoga species［J］.Biotechnology and Bioengineering，2002，80(2):185-194.

［16］ Devece C，Rodríguez-López J N，Fenoll L G，et al.Enzyme inactivation analysis for industrial blanching applications:comparison of microwave，conventional，and combination heat treatments on mushroom polyphenoloxidase activity［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1999，47(11):4 506-4 511.

［17］ Saha B C.Production，purification and properties of endoglucanase from a newly isolated strain of Mucor circinelloides［J］.Process Biochemistry，2004，39(12):1 871-1 876.

［18］ Saifuddin N，Raziah A Z.Enhancement of lipase enzyme activity in non-aqueous media through a rapid three phase partitioning and microwave irradiation［J］.Journal of Chemistry，2008，5(4):864-871.

［19］ Hartley B S，Hanlon N，Jackson R J，et al.Glucose isomerase:insights into protein engineering for increased thermostability［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2000，1 543(2):294-335.

［20］ Tumturk H，Demirel G，Altinok H，et al.Immobilization of glucose isomerase in surface-modified alginate gel beads［J］.Journal of Food Biochemistry，2008，3(2):234-246.

［21］ YANG Z，NIU X，FANG X.et al.Enantioselective esterification of ibuprofen under microwave irradiation［J］.Molecules，2013，18(5):5 472-5 481.