水稻貯藏特性與秈粳基因型的關系

劉 霞 杜雅榮 李喜宏 馬 文 王 威 劉香軍 高玉敏 李麗秀

（天津科技大學食品工程與生物技術學院1，天津 300457）（國家農產品保鮮工程技術研究中心2，天津 300384）（南開大學生命科學學院3，天津 300071）（天津捷盛東輝保鮮科技有限公司4，天津 300300）

水稻貯藏特性與秈粳基因型的關系

劉 霞1，3，4杜雅榮1李喜宏1馬 文1王 威1劉香軍1高玉敏1李麗秀2

（天津科技大學食品工程與生物技術學院1，天津 300457）（國家農產品保鮮工程技術研究中心2，天津 300384）（南開大學生命科學學院3，天津 300071）（天津捷盛東輝保鮮科技有限公司4，天津 300300）

實現以PCR為基礎的水稻種質的耐儲藏性檢測，將大大加快水稻及其他糧食作物耐儲藏品種的培育和推廣。本研究首先使用12個秈粳特異性PCR標記對育種與生產中常用的35個秈粳稻進行基因型鑒定，然后，依據基因型信息的聚類分析，將不同秈粳基因型水稻分為秈型、偏秈型、偏粳型和粳型共4類。結果表明，秈型和偏秈型品種老化指數均小于50%，而偏粳型和粳型水稻材料則大多不耐儲藏或儲藏性較差，偏粳型材料較粳型材料耐儲藏性好，并且儲藏后粳稻的總酸變化較劇烈。利用秈粳特異性標記的秈粳基因型分析與秈粳型態指標結合可以快捷、簡便而有效的鑒別特殊的耐儲藏品種，為耐儲藏品種篩選與育種提供基礎。

水稻 秈粳性 儲藏 基因型 陳化

我國60%左右的居民以大米為主食，但是，現階段缺糧10%以上，其中采后損失高達5%（包括食用和種子用），造成上百億元／年的經濟損失。長期以來，人們一直習慣氣調、溫調以及使用藥劑等傳統手段改善稻谷的貯藏性能，但也帶來了貯藏成本及藥劑殘留等問題，而且氣、溫的調控對占我國糧食貯藏總量70%～75%的農家散戶很難實行。相比而言，培育水稻耐貯藏品種是糧食貯藏中更為有效的方法與手段，其中，從基因水平診斷水稻種質的耐貯藏性能，通過“Breeding by design”［1］（設計育種）技術能夠更快地實現耐貯品種快速創生的目標、加快選擇耐貯藏種質的速度。

90年代初日本率先開展了水稻耐貯藏領域的研究，但目前為止，國內外多集中在雜交稻種子活力表現及其測定、各種貯藏條件下水稻理化性質的變化規律方面的研究，僅有少數論及水稻種子活力與其基因型有關的報道，但鮮見深入研究。稻谷耐貯藏性在品種間具有豐富的多態性，不同亞種間的耐貯藏性分別為秈稻＞爪哇稻＞粳稻，通過鑒定不同種質的耐貯藏基因，進而聚合耐貯藏相關基因，可有效改善水稻品種的耐貯性［2－3］。

稻米的陳化是一個復雜的過程，已鑒定了一些水稻耐貯藏 QTL位點［4－7］。然而，造成亞種間耐貯藏性差異的機制至今鮮見報道，關于水稻耐貯藏性與基因型結合的研究也鮮見深入開展。本研究旨在通過不同水稻品種自然老化處理，在綜合考察秈粳基因型的基礎上，比較不同基因型水稻的耐貯藏特性，研究不同基因型水稻的貯藏品質變化規律，闡明稻谷貯藏特性與秈粳基因型的關系，為進一步開展水稻耐貯藏性的分子診斷與陳化機理研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

水稻材料于2006年廣州市農業科學院水稻試驗基地（北緯 23°05′32″，東經 113°20′55″）進行種植。用于本研究材料隨機區組設計，3次重復種植，25 cm×15 cm行列間距。本研究所使用的水稻材料見表1。

材料于2006年11月收獲，收獲后測定各指標的初始值，并將不同水稻材料分別貯藏于網袋中，常溫自然貯藏30個月后測定水稻的各項理化指標，以進一步分析不同水稻品種的耐貯藏性。

表1 供試水稻材料

PCR引物：上海申能博彩生物有限公司；瓊脂糖：美國伯樂（BIO－RAD）有限公司。

PCR儀、凝膠成像系統：美國伯樂（BIO－RAD）有限公司；DYY－6C型電流儀：北京六一儀器廠；小型精米機：日本凱特KETT公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取

水培產生的水稻幼苗葉片采用CTAB法進行DNA提?。?］，提取好的DNA用水溶解后貯存于－20℃。

1.2.2 PCR分析

1）引物：水稻秈粳稻異性引物見表2，由上海申能博彩公司合成。

2）反應體系：PCR反應體系20μL，包括2μL 10 X緩沖液，100 ng模板，2μL dNTP（2.5 mmol／L），0.13 μL Taq酶，3μL 3’、5’引物（5μmol／L）及雙蒸水。PCR反應中的dNTP、Taq酶等均為申能博彩產品。

3）反應程序：94℃預變性 2 min；94℃ 30 s，55℃（或58℃）30 s，72℃ 30 s，35個循環；最后進行72℃延伸10 min，4℃保存。

4）PCR產物檢測：取8μL反應產物進行3%瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統進行拍照。

1.2.3 基因型與聚類分析

6對秈粳特異性SSR引物通過236對SSR標記對35個典型秈粳水稻品種的基因型分析篩選得到。SSR引物序列信息來自 Gramene數據庫（http：／／www.gramene.org），所使用引物均勻分布于水稻12條染色體上。其他6對秈粳特異性PCR標記由28個秈粳特異性RFLP標記［9］中的5個秈粳檢測率較高的標記轉換得到。用于水稻耐貯性分子診斷的引物序列信息見表2。

依據不同分子標記35個水稻品種中的基因型信息，進行35個水稻品種的聚類分析，采用NTSYSpc 2.0 for window進行。

表2 水稻耐貯性分子診斷的引物序列信息

1.2.4 水稻品質分析方法

以下項目的分析測定的樣品為新鮮或貯藏后稻谷通過小型精米機制備。分析項目和方法為：水分按 GB／T 5479—1985（105℃恒溫法）執行；酸度按GB／T 5517—1985執行。

1.2.5 老化指數

用老化指數表示種子耐貯藏特性，老化指數越高越不耐貯藏。

老化指數＝［（未老化發芽率－自然老化后發芽率）／未老化發芽率］×100%

1.3 數據處理與分析

全部試驗數據采用SPSS 19.0軟件進行統計處理和檢驗差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 秈粳基因型與老化指數的相關性

經過長期的秈粳分化、自然選擇和人工選擇，水稻的秈粳分化是深入和復雜的。稻谷貯藏特性與秈粳特性之間存在極顯著的相關［10］。本試驗利用篩選出的12個秈粳特異性標記對35個水稻品種進行基因型分析，依據基因型特異信息的聚類結果將35個水稻品種按親緣關系分為秈粳2個亞組（圖1）。

由秈粳聚類分析可知，粳稻組中，1187、津原36、W45、9204、越富、農林 29、341B、朝 8、日本晴、花育 446、花育409為典型的粳稻，親緣關系較近。津原38、9618－1、越光、津原101、8923和903為另一種類型的典型粳稻，這2組典型粳稻是經過長期的自然選擇和人工選擇分化出粳稻亞種的多態性。遼恢253、C602和C418屬于粳稻亞種，但其與典型粳稻相比這些粳稻基因組中包括了秈稻基因組成分，是秈粳雜交的橋梁品種。秈稻組中 IRBB60、桂99、矮腳南特、唐164、9311、の川、明恢63、珍汕97A、E32和廣東3號為典型的秈稻品種，與粳稻品種間多態性相比秈稻品種間的多態性較高。豐源B、川A和川B在育種過程中形成了特有的多態性特征，與其他秈稻相比具有獨特性。

根據聚類結果分析可將35份材料分為秈型、偏秈型、偏粳型和粳型4種類型（表3），分別有10、4、4和17份。每種秈粳類型水稻組間老化指數存在極顯著差異，可見與稻谷耐貯藏性相關的老化指數變化存在極大的秈粳特異性，秈型和偏秈型品種中，均未發現老化指數大于50%的材料，在偏粳型和粳型材料中，則以不耐貯藏或貯藏性較差為多，偏粳型材料較粳型材料耐貯藏性好，在粳型的17份材料中僅發現1份材料的耐貯藏性較好。

圖1 35個水稻品種的聚類分析

表3 自然老化及秈粳特性分析

2.2 秈粳性對稻谷超長期儲藏酸度的影響

大米中酸性物質主要由脂肪酶、植酸酶、蛋白酶等作用分解脂肪產生脂肪酸、分解磷脂產生磷酸和酸性磷酸鹽、分解蛋白質產生氨基酸、分解碳水化合物產生乳酸、酪酸和醋酸［9］，品質正常的大米含有的酸性物質很少。

根據秈粳基因型與老化指數分析的綜合結果，從35份材料中優選出 W45、9618、津原101、C418、矮腳南特、唐164、9311、の川和川B共8個代表性品種進行不同基因型稻谷儲藏品質總酸的變化規律研究。由圖2可見，新鮮的稻谷總酸值在不同品種間存在一定的差異，但變幅不大，除粳稻的津原101總酸值較小，秈稻的唐164總酸值較大，其他品種的總酸值均在0.2～0.4 mgKOH／100 g之間。比較兩亞種間總酸初始值可發現粳稻品種的初始總酸值較?。ň究偹崞骄禐?.246 mgKOH／100 g，秈稻總酸平均值為0.357 mgKOH／100 g）。然而，不同基因型水稻品種在自然條件下儲藏30個月后總酸均上升，秈粳稻兩亞種相比，典型秈稻品種總酸增長率較偏秈型、偏粳型和典型粳稻慢（表4），其中親緣關系較近的4個秈型稻谷唐164、9311和の川總酸變化率無顯著性差異，與秈粳聚類結果一致，其總酸增長率與親緣較遠的川B和其他4個代表粳稻之間差異顯著，并且粳稻之間耐儲藏性差異較秈稻更為明顯，各代表品種間總酸變化顯著。

圖2 不同基因型水稻自然貯藏30個月總酸的變化

表4 不同基因型水稻自然貯藏30個月總酸增長率的變化

現代分子生物學和分子遺傳學研究表明，控制同一性狀的基因具有多態性，同一基因的不同基因型在基因表達、蛋白質活性與特異性方面都存在差異。水稻耐儲藏性在品種間具有豐富的多態性，不同亞種間的耐儲藏性分別為秈稻 ＞爪哇稻 ＞粳稻［11］。造成種質間的耐儲藏性差異的原因可能是儲藏相關基因或其調控序列差異。例如Suzuki等［12］發現了LOX3缺失的水稻品種“Daw Dam”，研究表明LOX3缺失水稻脂肪酸氧化生成醛系物產量較具有LOX3水稻的品種低［13－14］。因此，初步推斷造成秈粳稻兩亞種總酸值差異的原因可能是秈粳稻形成酸性物質起作用的酶活性及含量的不同造成的，而這種不同可能是基因型或其調控序列的差異引起的。

2.3 耐儲藏種質的診斷與篩選

根據老化指數及秈粳基因型、形態學鑒定35份水稻材料的耐貯藏性與秈粳性的相關性。水稻秈粳基因型與水稻的耐儲藏性存在一定的一致性。例如粳稻品種大多數為不耐儲藏品種，而秈粳橋梁品種如C418的耐儲藏性較典型粳稻好。津原101是典型的粳稻，但是具有特殊基因型表現，與此相應在其儲藏特性上也表現了不同于典型粳稻的耐儲藏特性。因此，通過基因型可以快速、便捷地鑒定水稻耐儲藏性。

秈粳形態指數與水稻耐貯藏性也具有很好的相關性，基因型鑒定結合秈粳形態指數鑒定能夠更加精確的對不同水稻種質的耐貯藏性進行診斷。秈粳稻耐儲藏性能比較結果表明，秈稻較粳稻耐儲藏。對于特殊秈稻品種的耐儲藏性鑒定，如具有特殊基因型的川B，在基因型鑒定的基礎上可進一步通過快速老化試驗來驗證其耐儲藏性。

在35份水稻材料中耐儲藏性較好的粳稻有2份，其他耐儲藏的水稻大多為秈稻品種。尋找秈稻耐儲藏基因，通過基因聚合育種、轉基因等技術可將秈稻耐貯藏基因轉入優質粳稻品種中可實現優質、耐貯藏品種的培育［2］。

3 討論

鑒定水稻耐貯種質資源，一方面可通過自然、人工老化處理鑒定，另一方面可通過分子診斷鑒定。在實踐上，鑒定水稻耐儲藏基因與新型分子標記是進行水稻儲藏分子診斷的基礎。不同亞種間的耐儲藏性分別為秈稻＞爪哇稻＞粳稻，利用耐儲藏基因資源培育優質、高產、高抗、耐貯品種將對我國水稻儲藏水平提高起到根本性作用。

脂肪酸氧化是稻谷陳化的主要因素，脂肪酸氧化首先是脂肪在脂質降解關鍵酶脂肪酶（三酰甘油酯水解酶，Lipase，EC 3.1.1.3）的作用下分解為甘油和不飽和脂肪酸［15－17］，脂肪酸積累啟動脂肪酸氧化酶（LOX－1、LOX－2、LOX－3）氧化脂肪酸產生醛、酮等揮發性物質和氫過氧化物以及衍生物和自由基稻谷陳化變質，因此脂肪酶和脂肪酸氧化酶是稻谷陳化的關鍵酶，其表達量與表達效果對水稻的耐儲藏性具有重要的作用。本研究發現的秈粳特異性SSR標記RM405通過Blast分析表明該標記位于脂肪酶家族基因的第三內含子內（lipase of class 3 family），粳稻較秈稻在這一脂肪酶基因內有更多的（AC）重復序列。造成秈粳稻耐貯藏性上差異的分子機理尚不明確，本研究發現的簡單重復序列RM405所在區域的多態性可能是引起秈粳稻脂肪氧化差異的重要因素之一，這一結果還需進一步驗證。

所謂的秈粳特異性標記是能夠在大多數或全部秈／粳亞種間表現出兩亞種基因型差異的標記，而出現這一現象的原因很可能是在這些秈／粳特異性標記位點處存在秈／粳特異性基因。秈粳特異性SSR標記多態性來源于秈粳基因組序列多態性，其變異來源于SSR基序的基因組間不對稱交換，在秈粳稻基因組序列上表現為簡單重復序列基序重復數的不同。秈粳特異性RFLP標記轉化得到的秈粳特異性PCR標記在基因組序列多態性上表現為序列的缺失與插入，所有這些秈粳基因組序列的差異表現在形態、理化性質上的秈粳差異。水稻秈粳特有基因鑒定、基因型與性狀的特異性組合將為水稻的分子育種奠定基礎。

水稻的耐儲藏特性與秈粳基因型之間存在著極顯著相關性，可能意味著水稻秈粳分化與耐儲藏特性之間有著相似或相近的遺傳背景。已有大量研究表明，水稻的耐儲藏性與水稻的亞種具有一致性，本研究利用秈粳基因型標記鑒定水稻的秈粳性來鑒定水稻的耐儲藏性取得了較為一致的研究結果，因此在選育耐儲藏品種時，除可利用秈粳特異性標記鑒定水稻品種的耐儲藏特性外，還可以利用秈粳特異性標記的篩選進一步開發耐儲藏基因資源，為耐儲藏基因鑒定奠定基礎。

4 結論

12個秈粳特異性PCR標記可以很好的將水稻品種進行分類，秈粳特異性與水稻的耐儲藏性間存在極大的相關性，利用秈粳特異性標記能很好的診斷水稻的耐儲藏性能，結合秈粳形態指數鑒定水稻的耐儲藏性是一種快捷、簡便而有效的手段。秈稻較粳稻耐儲藏，其分子機理首先表現在秈粳基因型的不同。

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Relationship Between Storage Stability and Genotype of Rice（Oryza Sativa L.）

Liu Xia1，3，4Du Yarong1Li Xihong1Ma Wen1Wang Wei1Liu Xiangjun1Gao Yumin1Li Lixiu2
（Tianjin University of Science and Technology1，Tianjin 300457）（National Engineering Technology Research Center for Preservation of Agricultural Products2，Tianjin 300384）（College of Life Science，Nankai University3，Tianjin 300071）（Tianjin Gasin－Donghui Preservation.Technologies Co.，LTD.4，Tianjin 300300）

Technology of storage stability testing，which based on developing ofmolecular markers and PCR technology，would significantly speed up the process of breeding and developing for storage tolerance in rice and other crops.In this study，12 subspecies specificmolecularmarkers based on PCR were used to analyze the genotype of35 rice varieties.And then，the rice of35 varietieswere classified into four groups by clustering analysis of genotype information，including indica，sub－indica，sub－and japonica.Among them，the aging index were all low than 50%in indica and sub－indica varieties，but the storage stability of japonica were almost poor.And sub－japonica varieties'storage stability was good than japonica.And the same time，total acid was rapidly increasing in japonica than indica rice.More important，the diagnosingmethod for storage tolerance was quick，convenient and effective，which would integratemolecular diagnostics and special indica－japonica phenotype characteristic together.Itwas the groundwork for pyramiding breeding of high quality，high yield and storage stability.

rice，subspecies specific，storage，genotype，aging

S379.2

A

1003－0174（2015）11－0001－06

國家自然科學基金（31000826），天津市自然科學基金（12JCZDJC23400），天津科技大學科學研究基金（2012 0108）

2014－04－30

劉霞，女，1976年出生，副研究員，植物生理與分子生物學、糧食陳化機理

李喜宏，男，1960年出生，教授，農產品采后生理及貯藏保鮮技術