甘油、乙二醇對山羊精子形態結構的影響

黃亞娟劉文娟邸俊龍

1.陜西省涇陽縣涇干鎮動物防疫站，陜西涇陽 713700；2.陜西省榆林市靖邊縣鎮靖鄉畜牧獸醫工作站，陜西靖邊 718500；2.西安市閻良區關山鎮畜牧獸醫站，西安 710089

甘油、乙二醇對山羊精子形態結構的影響

黃亞娟1劉文娟2邸俊龍3

1.陜西省涇陽縣涇干鎮動物防疫站，陜西涇陽 713700；2.陜西省榆林市靖邊縣鎮靖鄉畜牧獸醫工作站，陜西靖邊 718500；
2.西安市閻良區關山鎮畜牧獸醫站，西安 710089

根據布爾山羊冷凍精液質量監測結果，目前國內山羊冷凍精液解凍后的活力達30%以上。情期受胎率達60%左右，遼寧原種場在此基礎上于2004年開始對遼寧絨山羊細管冷凍精液的稀釋液、精液處理，冷凍工藝解凍方法及受胎率結果等作了比較系統的研究，取得了較好的結果。本試驗通過對最佳基礎液的篩遠，最佳保護劑種類及含量的篩選，分別用含甘油、乙二醇的最佳冷凍稀釋液對山羊的精液進行處理，根據冷凍和解凍的結果，對精子活率、畸形率，頂體完整率進行研究。

甘油；乙二醇；情期受胎率；精子活率

1 材料與方法

1.1 試驗材料

體格健壯、健康無傳染病且性欲旺盛的種公羊，精液要求呈現乳白色成略帶黃色云霧狀明顯，pH在6.8±0.2范圍內，目測活率在0.7以上，種公羊均身體健康，精神狀態良好。

供選擇的稀釋液配方如下：

Ⅰ基礎液：葡萄糖8 g、雙蒸水100 mL，滅菌。（1）處理：8.0 mL基礎液+2.0 mL卵黃+0.35 mL甘油；（2）處理：8.0 mL基礎液+2.0 mL卵黃+0.5 mL甘油。

Ⅱ基礎液：葡萄糖3 g、檸檬酸鈉3 g、雙蒸水100 mL，滅菌。（1）處理：8.0 mL基礎液+2.0 mL卵黃+0.35 mL甘油；（2）處理：8.0 mL基礎液+2.0 mL卵黃+0.5 mL甘油。

Ⅲ基礎液：三羥甲基氨基甲烷4.34 g、葡萄糖0.70 g、蔗糖1.60 g、檸檬酸鈉1.972 g、雙蒸水100 mL，滅菌。（1）處理：8.0 mL基礎液+2.0 mL卵黃+0.35 mL甘油；（2）處理：8.0 mL基礎液+2.0 mL卵黃+0.5 mL甘油。

Ⅳ基礎液：乳糖4.6 g、葡萄糖3.1 g、檸檬酸鈉1.5 g、雙蒸水100 mL，滅菌。（1）處理：8.0 mL基礎液+2.0 mL卵黃+0.35 mL甘油；（2）處理：8.0 mL基礎液+2.0 mL卵黃+0.35 mL乙二醇；（3）處理：8.0 mL基礎液+2.0 mL卵黃+0.47 mL甘油；（4）處理：8.0 mL基礎液+2.0 mL卵黃+0.47 mL乙二醇。

Ⅴ基礎液：乳糖5 g、葡萄糖3 g、檸檬酸鈉1.5 g、雙蒸水100 mL，滅菌。（1）處理：8.0 mL基礎液+2.0 mL卵黃+0.35 mL甘油；（2）處理：8.0 mL基礎液+2.0 mL卵黃+0.5 mL甘油。

Ⅵ基礎液：乳糖6 g、檸檬酸鈉1.5 g、雙蒸水100 mL，滅菌。（1）處理：8.0 mL基礎液+2.0 mL卵黃+0.35 mL甘油；（2）處理：8.0 mL基礎液+2.0 mL卵黃+0.5 mL甘油。

Ⅶ基礎液：乳糖3.8 g、葡萄糖2.6 g、檸檬酸鈉1.3 g、雙蒸水100 mL，滅菌。（1）處理：8.0 mL基礎液+2.0 mL卵黃+0.35 mL甘油；（2）處理：8.0 mL基礎液+2.0 mL卵黃+0.5 mL甘油。

Ⅷ基礎液：葡萄糖1.15 g、檸檬糖2.6 g、檸檬酸1.0 g、二羥甲基氨基甲烷1.84 g、雙蒸水100 mL，滅菌。（1）處理：8.0 mL基礎液+2.0 mL卵黃+0.35 mL甘油；（2）處理：8.0 mL基礎液+2.0 mL卵黃+0.5 mL甘油。

VⅢ基礎液：葡萄糖0.96 g、檸檬酸鈉1.36 g、二羥甲基氨基甲烷2.42 g、雙蒸水100 mL，滅菌。（1）處理：基礎液8.0 mL+2.0 mL卵黃+0.35 mL甘油；（2）處理：基礎液8.0 mL+2.0 mL卵黃+0.5 mL甘油。

以上每種基礎液消毒滅菌后放涼，再按每毫升各加青霉素、鏈霉素1 250 IU混勻即可保存。

1.2 試驗設計

選用合格新鮮精液，按以上20個稀釋液分別進行處理，每個處理6個重復，根據冷凍解凍后的活率選出最佳稀釋液的基礎液，將選出的基礎液按表1濃度添加保護劑，配成稀釋液，用此稀釋液再進行冷凍處理，每個處理重復6次，再以解凍后精子的活率、畸形率，頂體完整率，得出分析結果（表2）。

表1 保護劑的添加量

表2 基礎液的篩選結果

1.3 試驗過程

1）將所需用品嚴格消毒后，將鏡檢合格的新鮮精液按1∶3體積比稀釋后，裝管置于0～4℃環境中平衡2 h。

2）平衡后，將細管精液置于液氮中冷凍5～10 min。

3）解凍鏡檢：將冷凍后的精液置于38℃水浴中解凍后，制切片，觀察活率。

4）標記分裝，保存，對統計數據進行分析，選出最佳基礎液。

5）用最佳基礎液按表1配成稀釋液，重復以上操作分別選出甘油、乙二醇的最佳稀釋液A、B。

6）用A、B 2個稀釋液作冷凍精液處理，制作抹片，進行活率、畸形率，頂體完整率的觀察。

7）對結果進行統計分析，得出結論。

2 結 果

2）IV基礎液中添加不同濃度甘油對精子成活率的影響結果（=6）。由活率為依據進行選擇，添加4.7%的甘油的效果明顯好于其他濃度，經顯著性檢驗，添加4.7%的甘油組與總體樣本比較，差異顯著（＜0.05），故可以選擇甘油的最佳濃度為0.47（表3）。

表3 不同濃度甘油對精子成活率的影響結果

表4 不同濃度乙二醇對精子成活率的影響結果

4）用A（含4.7%甘油）、B（含4.7%乙二醇）、C（新鮮精液）3個處理組對精子畸形率的影響（n=6）。甘油處理組的畸形率顯著高于對照組和乙二醇處理組（＜0.01）；乙二醇的處理組的畸形率顯著高于對照組（＜0.01）（表5）。

表5 不同處理組對精子畸形率的影響結果

表6 不同處理組對精子頂體完整率的影響結果

3 討 論

冷凍精液人工授精技術應用到生產中以來，只是在牛的生產上應用比較多。由于冷凍精液的活率、畸形率、頂體異常率等各方面因素的影響，使得受胎率于自然交配相比較低，從而使此技術在山羊生產上未得到大面積推廣。因此保護劑添加的種類和濃度，是目前研究的一個熱點。精子在冷凍過程中，水分子重新按幾何圖形排列形成冰晶，冰晶可以使精子膜內的濃度和滲透壓增高，水由精子內向外滲透，造成精子細胞脫水，發生不可逆的化學毒害而死亡。同時，精子水分形成冰晶，其體積增大且形狀不規則，由于冰晶的擴展和移動，造成精子膜和細胞內部結構的機械損傷，引起精子死亡，所以，在冷凍過程中要盡量避開形成冰晶最多的溫度范圍（-15～25℃），在冷凍過程中就要以最快的速度降溫通過發生冰晶化的溫度范圍，形成玻璃化?？焖俳禍貢r應添加一定量的甘油、乙二醇、二甲亞砜等抗凍保護物質，以增加精子的抗凍能力，防止發生冰晶化。

保護劑中，甘油具有較強的吸水性，抑制水分子形成冰晶，使水處于過冷狀態，降低水形成冰晶的溫度，縮小危險溫度區。研究表明，甘油濃度過高對精子有毒害作用，可能造成其頂體和頸部損傷，尾巴彎曲及某些酶類破壞，降低其受精能力。乙二醇具有較強的親水性能，能有效保護精子免受冰晶傷害，而且其濃度過高對于精子的毒害作用遠小于甘油。

本試驗研究發現，在低濃度的保護劑作用下（0.30～0.35 mL范圍內/10 mL冷凍稀釋液中），甘油的保護作用與乙二醇的保護作用相比，差異不顯著，也就是二者并沒有本質的區別，保護劑體積增加到0.35 mL以上時，乙二醇的保護作用明顯強于甘油，當保護劑體積達到0.5 mL時，二者的保護作用都呈于下降趨勢，在這個過程中，精子的形態結構也發生了一系列的變化，本試驗設置了2個處理組和1個對照組，即用所選擇的最佳基礎液，分別加入最適濃度的甘油和乙二醇后，制作抹片，在油鏡下統計出了各自的畸形率、頂體完整率，再以新鮮精液制成抹片作為對照組來進行生物統計學分析，結果發現，無論是甘油，還是乙二醇處理組，都與對照組差異顯著，也就是說，在添加保護劑的過程中，精子的活率、畸形率、頂體完整率都不可避免地受到了很大的影響，甘油與乙二醇的處理組相比，甘油處理組的效果無論從活率、畸形率還是頂體完整率上分析，都不如乙二醇處理組好。

另外，在這個實驗的整個研究過程中，還存在一些不可知因素的影響，還存在一些尚未解決的問題，如在研究過程中，基礎液、稀釋液的原始配方都選取的一些實際生產中常用的一些配方，這些配方添加保護劑的濃度都是從3%開始，5%結束，那么3%以下的添加濃度，按照理論知識，甘油應明顯強于乙二醇5%以上的添加濃度，乙二醇應明顯強于甘油，但試驗研究的添加濃度具有局限性，因而出現了一些不一致的地方，有待于進一步的探討。就整個冷凍過程中，氣溫、光線、冷凍時間的微小差異，都有可能導致結果出現微小的偏差。在解凍過程中，水溫的高低、解凍時間的長短以及解凍技術的熟練程度，也都會對結果產生一定影響。本試驗在基礎液中添加的營養劑為蛋黃，根據實際生產上的經驗，添加等量鮮奶的效果優于蛋黃，以上是整個試驗中存在的一些問題。

4 結 論

本試驗結果表明，稀釋液中添加4.7%的甘油和乙二醇時，對精子形態結構以及活率都有顯著的影響，在選定的最佳稀釋液中，甘油的保護作用不及乙二醇，添加甘油對精子的活率、畸形率、頂體完整率的損害程度要強于乙二醇。在實際的生產中，建議盡可能用乙二醇作為保護劑。

[1]張忠誠.家畜繁殖學[M].北京：中國農業出版社，2004.

[2]中國農業大學出版社主編.家畜繁殖學[M].北京：中國農業出版社，1980.

[3]張世偉，宋先忱，朱延旭，等.遼寧絨山羊細管冷凍精液研究[J].中國畜牧雜志，2006（3）：23-25.

[4]董時富.生物統計學[M].北京：科學教育出版社，2000.

[5]明道緒.生物統計附實驗設計[M].北京：中國農業出版社，2004.

[6]張一玲.家畜繁殖學實驗實習指導[M].北京：農業出版社，1991.

2015-08-16

黃亞娟，女，1984年生，碩士。