萌發菌HL-003胞內多糖的提取及抗氧化性研究

鄭朋朋，楊曉波，李 珊，陳玉惠，敖新宇

（西南林業大學生命科學學院，云南昆明650224）

萌發菌HL-003胞內多糖的提取及抗氧化性研究

鄭朋朋，楊曉波，李 珊，陳玉惠，敖新宇*

（西南林業大學生命科學學院，云南昆明650224）

采用乙醇沉淀法提取多糖，在單因素試驗基礎上進行正交試驗，探討萌發菌HL-003胞內多糖提取的最佳條件；分別采用Fe2+/H2O2體系和鄰苯三酚自氧化法探討多糖清除羥基自由基和氧自由基的能力。結果表明，最佳提取條件為液料比20∶1（m L∶g）、提取時間1.5 h、提取溫度70℃、乙醇體積分數80%，其最佳提取率為7.63%；萌發菌HL-003胞內多糖對羥自由基和氧自由基清除作用明顯，是一種良好的天然抗氧化劑。

萌發菌；多糖提??；正交試驗；抗氧化性

真菌多糖是指從各種真菌的子實體或菌絲體分離提取的一類高分子化合物，是人體健康的重要營養和保健成分[1-5]。真菌多糖可應用于人類的疾病治療和保健，具有調節機體免疫力、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗輻射、抗衰老、健胃保肝、降血糖、血脂、血壓等多種功能[6-10]。胞內多糖不僅具有多方面的生物活性，且多無毒，是比較理想的藥物，如昆布多糖和肝素有抗凝血作用，硫酸軟骨素可防止血管硬化。除了食用菌多糖（如銀耳多糖、靈芝多糖、蜜環菌多糖）外，刺五加多糖、黃芪多糖、茯苓多糖、枸杞多糖等還具有免疫功能和抗腫瘤作用[10-12]。

萌發菌HL-003是天麻種子萌發時的共生菌，為真菌界擔子菌門小菇屬（Mycena），屬于高等擔子菌[13-17]。本研究針對萌發菌HL-003胞內多糖進行提取條件優化和體外抗氧化性研究。通過對萌發菌HL-003胞內多糖提取過程中液料比、浸提溫度、提取時間、乙醇體積分數4個因素進行單因素試驗，在單因素試驗基礎上進行正交試驗，從而對萌發菌HL-003胞內多糖提取工藝進行優化篩選；并對分離提取的胞內多糖進行體外抗氧化性探究。旨在探究提取萌發菌HL-003胞內多糖最優工藝條件和胞內多糖抗氧化性能力，為拓展和大規模生產萌發菌HL-003胞內多糖提供參考依據，同時也為其他的真菌胞內多糖的提取提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

萌發菌HL-003：西南林業大學生命科學學院生化教研組提供。

1.1.2 試劑

葡萄糖、瓊脂、KH2PO4、MgSO4、蒽酮、水楊酸、硫酸亞鐵、Tris、鄰苯三酚均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司；正丁醇、氯仿、無水乙醇、濃硫酸、HCl、H2O2：汕滇藥業有限公司。

1.2 儀器與設備

BHC-1300無菌超凈工作臺：江蘇泰諾源生物技術有限公司；HZ-88搖床：常州普天儀器制造有限公司；BS224S電子天平、Eppendorf-5430 R離心機：德國賽多利斯公司；MLS-3750高壓滅菌鍋：日本Sanyo公司；RE-2000E真空旋轉蒸發儀：無錫中冶結晶器有限公司；UNIC-WFZVU-480s紫外分光光度計：上海精密儀器儀表有限公司；HWS-12水浴鍋：上海一恒電熱恒溫水浴鍋；DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海環試電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 萌發菌HL-003菌絲體的制備

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）進行菌株的活化與擴繁，之后接入馬鈴薯葡萄糖（potato dextrose，PD）培養基進行液體發酵培養15 d[18]。三層紗布過濾，蒸餾水反復沖洗菌絲體；菌絲體放入60℃烘箱烘干，粉碎過篩后裝入廣口瓶，放入干燥器備用。

1.3.2 菌體胞內多糖的提取與測定

萌發菌胞內多糖的提取流程如下：

菌絲體粉末→水提→濃縮→脫蛋白→醇析→粗多糖→蒸餾水透析12 h→精制多糖→定容待測

葡萄糖標準曲線繪制：準確稱取105℃烘箱恒質量的葡萄糖10mg，溶解后定容至100m L，配成100μg/m L的葡萄糖標準液。分別準確移取0、0.2m L、0.4m L、0.6m L、0.8m L、1.0 m L標準液于試管中，用蒸餾水補水至1 m L，立即加入4.0 m L蒽酮-硫酸試劑，迅速置于冰水浴中冷卻，各管加完后一起浸于沸水浴中，準確煮沸10 min后取出，用流水冷卻，室溫放置10 m in，在波長620 nm處測定吸光度值，運用Origin 8.0對結果進行分析，繪制葡萄糖標準曲線。

多糖含量測定：取1 m L稀釋10倍后的待測溶液放入試管中（1 m L蒸餾水作空白對照），其他步驟同上。多糖提取率按照公式（1）計算：

式中：A為波長620 nm處的吸光度值；m為菌絲體粉末質量，g。

1.3.3 單因素試驗

液料比對多糖提取率的影響：在浸提溫度60℃，提取時間2.0h，乙醇體積分數75%條件下，分別設定液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（m L∶g）進行單因素試驗。

浸提溫度對多糖提取率的影響：在液料比20∶1（m L∶g），提取時間2.0 h，乙醇體積分數75%條件下，分別設定浸提溫度40℃、50℃、60℃、70℃、80℃進行單因素試驗。

提取時間對多糖提取率的影響：在液料比20∶1（m L∶g），浸提溫度60℃，乙醇體積分數75%條件下，分別設定提取時間1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h進行單因素試驗。

乙醇體積分數對多糖提取率的影響：在液料比20∶1（m L∶g），浸提溫度60℃，提取時間2.0 h條件下，分別設定乙醇體積分數50%、60%、70%、80%、90%進行單因素試驗。1.3.4正交試驗

在單因素試驗的基礎上選定合理的試驗因素水平進行正交試驗設計[21]。分別對液料比（A）、浸提溫度（B）、提取時間（C）、乙醇體積分數（D）選取3個水平，運用SPSS軟件進行4因素3水平正交試驗，對試驗結果進行軟件分析，得出最佳的試驗條件，正交試驗的因素水平設計見表1。

表1 多糖提取條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for polysaccharide extraction conditions optimization

1.3.5 抗氧化性試驗

多糖清除·OH能力的測定：采用Fe2+/H2O2體系測定糖提取液清除·OH的能力[22-23]。分試驗組和對照組，試驗組分別為粗多糖和精多糖，加入不同質量濃度樣品本底組，通過預實驗確定待測樣品濃度梯度。然后在10 m L的離心管中加入6 mmol/L水楊酸-無水乙醇和6 mmol/L硫酸亞鐵各1 m L后，加入不同質量濃度的樣品液1 m L（加1 m L不同質量濃度的VC溶液作為參比；加1 m L雙蒸水作為空白），最后加1 m L 6 mmol/L H2O2（樣品本底管加1 m L H2O），立即置37℃水浴30 min。在波長510 nm處測量吸光度值A，試驗重復3次，清除率按下式計算：

式中：A1為對照吸光度值，A2為樣品吸光度值，A3為樣品本底吸光度值。

多糖抑制超氧陰離子自由基（O2-·）生成能力測定：采用鄰苯三酚自氧化法[20]，測定O2-·清除能力[24-25]。通過預實驗確定實驗物濃度梯度后在試管中首先加入4.5 m L 50 mmol/L Tris-HCL緩沖液（pH 8.20，含1mmol/L二乙基三胺五乙酸），然后再加入不同濃度樣品液1 m L（加入1 m L不同溶度的VC溶液作為參比）、蒸餾水3.2 m L，對照管中加4.2 m L蒸餾水，25℃水浴30 min，再加入300 μL 3 mmol/L鄰苯三酚（含10 mmol/L HCl）后，立即在吸收波長325 nm處，每隔30 s記錄1次吸光度值，測量時間3 min，試驗重復3次。按下式計算抑制率：

式中：ΔA對照表示對照溶液吸光度值隨時間變化率；ΔA樣品為樣品溶液吸光度值隨時間變化率。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

采用Origin8.0測量結果進行分析和繪圖，以葡萄糖質量濃度（C）為橫坐標，吸光度值（A）為縱坐標，得到標準曲線如圖1所示。得到線性回歸方程：A=0.003 95C-0.006 07，相關系數R2=0.998，表明線性關系良好。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 單因素試驗

2.2.1 液料比對多糖提取率的影響

液料比對多糖提取率的影響如圖2。由圖2可知，液料比在10∶1～20∶1（m L∶g）時，HL-003胞內多糖的提取率隨著液料比的增加而逐漸增大，當液料比為20∶1（m L∶g）時，HL-003胞內多糖的提取率達到最大值，液料比再增加，多糖提取率不再增加，表明最佳液料比為20∶1（m L∶g）。

圖2 液料比對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of polysaccharides

2.2.2 浸提溫度對多糖提取率的影響

圖3 浸提溫度對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharides

浸提溫度對多糖提取率的影響如圖3。由圖3可知，浸提溫度在40～60℃時，隨浸提溫度升高，HL-003胞內多糖的提取率隨之增大，浸提溫度為60℃時，HL-003胞內多糖的提取率達到最大，繼續升高浸提溫度多糖提取率有所下降，表明最佳浸提溫度為60℃。

2.2.3 提取時間對多糖提取率的影響

提取時間對多糖提取率的影響見圖4。由圖4可知，提取時間在1.0～2.0 h時，提取時間延長，HL-003胞內多糖的提取率也隨之增大，提取時間為2.0 h時，HL-003胞內多糖的提取率達到最大，繼續延長時間多糖提取率有所下降，表明最佳提取時間為2.0 h。

圖4 提取時間對多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharides

2.2.4 乙醇體積分數對多糖提取率的影響

乙醇體積分數對多糖提取率的影響見圖5。由圖5可知，乙醇體積分數在50%～80%時，隨著乙醇體積分數增加，HL-003胞內多糖的提取率也隨之增大，乙醇體積分數為80%時，HL-003胞內多糖的提取率達到最大，繼續延長時間多糖提取率有所下降，表明最佳乙醇體積分數為80%。

圖5 乙醇體積分數對多糖提取率的影響Fig.5 Effect of ethanol content on extraction rate of polysaccharides

2.3 正交試驗

分別以液料比（A）、浸提溫度（B）、提取時間（C）、乙醇體積分數（D）為評價因素，多糖提取率為評價指標，正交試驗結果與分析見表2。

表2 多糖提取條件正交試驗優化結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for polysaccharides extraction conditions optimization

由表2可知，各因素對多糖提取率的影響為A＞D＞B＞C，液料比對多糖提取率的影響最大，乙醇體積分數次之，浸提溫度再次之，提取時間最小。在試驗范圍之內最佳優化組合為A2B3C1D2，即提取液料比為20∶1（m L∶g），浸提溫度為70℃，提取時間為1.5 h，乙醇體積分數為80%。在此條件下，萌發菌HL-003多糖提取率最高，為7.63%。

2.4 多糖抗氧化性試驗

2.4.1 多糖清除·OH能力

圖6 多糖及VC對·OH的清除率Fig.6 Scavenging rate of polysaccharides and VC on·OH

多糖和VC清除·OH能力如圖6所示。由圖6可知，胞內粗多糖和精多糖都具有清除·OH的能力，其中5 mg/m L精多糖清除能力最大，可達79.7%。具有一定的清除·OH的能力。相同質量濃度下，精制多糖清除·OH的能力強于粗多糖?！H的清除率與多糖質量濃度成正相關性即多糖質量濃度越高，清除·OH的能力也越強，與相同質量濃度的VC相比較，粗多糖、精多糖的清除·OH能力弱于VC。

2.4.2 多糖抑制O2-·生成能力

多糖和VC抑制O2-·生成能力如圖7所示。由圖7可知，萌發菌HL003胞內粗多糖、胞內精制多糖都具有抑制O2-·的能力，多糖純度越高，效果越好，相同質量濃度下精制多糖對O2-·生成的抑制強于粗多糖，當精制多糖質量濃度達5mg/m L時對O2-·生成的抑制率最高，可達66.4%。但與相同質量濃度的VC相比，粗多糖、精多糖的抑制率要比VC弱。

圖7 多糖及VC對O2-·的抑制率Fig.7 Scavenging rate of polysaccharides and VC on O2-·

3 結論

在單因素試驗的基礎上進行正交試驗，優化出萌發菌HL-003胞內多糖的最佳提取條件為：液料比20∶1（m L∶g），浸提溫度70℃，提取時間1.5 h，乙醇體積分數80%，在此條件下，多糖提取率為7.63%。對胞內多糖的抗氧化性的研究表明，萌發菌胞內多糖具有較強的抗氧化活性，尤其是精多糖，其中5mg/m L精多糖對羥自由基的清除效率達到79.7%，抑制氧自由基的效率達到66.4%?？梢娒劝l菌胞內多糖具有開發利用的價值。

[1]王琦.蟹味菇的營養價值及生物活性成分研究[J].食品研究與開發，2010，31（1）：173-174.

[2]周小鷺.真菌多糖與人體健康[J].黑龍江生態工程職業學院學報，2009（5）：72-74.

[3]OOI V E,LIU F.Immunomodulation and anti-cancer activity of polysaccharide-protein complexes[J].Curr Med Chem,2000,7(7):715-729.

[4]顧芳紅，殷紅，馬勁.碳、氮源對豬苓菌絲生長與胞外多糖含量的影響[J].西北大學學報：自然科學版，2001，31（5）：437-440.

[5]MASUDA Y,ITO K,KONISHI M,et al.A polysaccharide extracted from Grifolafrondosa enhances the anti-tumor activity of bone marrow-derived dendritic cell-based immunotherapy against murine colon cancer[J].Cancer Immunol Immun,2010,59(10):1531-1541.

[6]LIU J J,HUANG T S,HSUC M L,et al.Antitumor effects of the partially purified polysaccharides from Antrodia camphorata and the mechanism ofits action[J].Toxicol Appl Pharm,2004,201:186-193.

[7]WASSER S P.Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomodulating polysaccharides[J].Appl Microbiol Biotechnol,2002, 60:258-274.

[8]郭欣，劉東紅，葉興乾.海洋動物中具重復序列硫酸多糖的抗凝血活性構效機理研究進展[J].中國食品學報，2013（11）：116-123.

[9]郭龍，楊英來，楊濤，等.高硫代度紅芪多糖硫酸酯的制備及體外抗凝血活性研究[J].藥學學報，2013，48（11）：1665-1670.

[10]梅天笑，王小鶯，萬根，等.多糖的修飾及其抗凝血活性研究進展[J].江西農業大學學報，2013，35（5）：1108-1113.

[11]張文州.食藥用真菌多糖的研究進展[J].食品工業科技，2014，35（15）：395-399.

[12]XU W,ZHANG F,LUO Y,et al.Antioxidant activity of a water-soluble polysaccharide purified from Pteridium aquilinum[J].Carbohyd Res, 2009,344(2):217-222.

[13]謝洪霞，王振濤，向蕓慶，等.酸奶自然發酵劑“西藏靈菇”菌體微觀絲狀物的培養與鑒定[J].中國釀造，2009，28（2）：60-61.

[14]徐錦堂，郭順星，范黎，等.天麻種子與小菇屬真菌共生萌發的研究[J].菌物系統，2001，20（1）：137-141.

[15]鄭曉君，葉靜，管常東，等.蘭科植物種子萌發研究進展[J].北方園藝，2010（19）：206-209.

[16]朱泉，田甜，楊澍，等.蘭科植物種子的非共生萌發研究進展[J].江蘇農業科學，2009（4）：205-208.

[17]郭順星，王秋穎.促進天麻種子萌發的石斛小菇優良菌株特性及作用[J].菌物系統，2001，20（3）：408-412.

[18]張藝子涵，張群，王平平.羊耳蒜菌根真菌培養條件的優化[J].北方園藝，2014（7）：102-106.

[19]張文州.食藥用真菌多糖的研究進展[J].食品工業科技，2014，35（15）：395-399.

[20]殷東林，王銳麗，段鴻斌.蛹蟲草子實體蟲草多糖提取工藝的優化[J].江蘇農業科學，2014，42（7）：277-279.

[21]呂志強，李喬.正交試驗優選桑籽中總生物堿、總黃酮及粗多糖的提取工藝[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20（14）：27-30.

[22]鮑敏，曾陽.粗柄羊肚菌胞外多糖的體外抗氧作用研究[J].食用菌，2014，36（2）：63-64.

[23]何鋼，顏軍，郭曉強，等.生何首烏多糖的單糖組成及清除羥自由基的活性測定[J].西北師范大學學報：自然科學版，2013，49（4）：70-75.

[24]楊青松，趙艷.響應面法優化藏藥紅雪茶多糖提取工藝[J].食品工業，2013（8）：44-48.

[25]趙晶麗，高紅梅，于海帥.枸杞多糖對高脂血癥大鼠血脂代謝及氧自由基的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（5）：241-243.

Extraction and antioxidant activity of intracellular polysaccharide from germination fungus HL-003

ZHENG Pengpeng,YANG Xiaobo,LI Shan,CHEN Yuhui,AO Xinyu*
(Co llege of Life Science,Southwest Forestry University,Kunming 650224,China)

Polysaccharides were extracted by ethanol precipitation,and the optimum conditions for intercellular polysaccharide extraction from germination fungus HL-003 were determined by single factor experiment and orthogonal experiment.The hydroxyl radicals and oxygen radicals scavenging activity of polysaccharide were determined by Fe2+/H2O2system and pyrogallol autoxidation method.Results showed that the optimal extraction conditions were liquid-solid ratio 20∶1(m l∶g),extraction time 1.5 h,extraction temperature 70℃,alcohol content 80%,and the optimum extraction rate was 7.63%.Polysaccharides have strong scavenging activity on hydroxyl radicals and oxygen radicals and they are good natural antioxidant.

germination fungus;polysaccharide extraction;orthogonal experiment;antioxidant activity

TS201.2

A

0254-5071（2015）03-0071-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.016

2015-01-19

云南省優勢特色重點學科生物學一級學科建設項目（50097505）

鄭朋朋(1990-)，男，碩士研究生，研究方向為生物化學與分子生物學。

*通訊作者：敖新宇（1978-），男，副教授，碩士，主要從事分子生物學研究工作。