響應面法優化油棗中總黃酮的提取工藝

王爭爭，楊慶文，楊宇霞，張 磊，趙 欣，李 慧

（1.山西省生物研究所，山西太原030006；2.山西農業大學園藝學院，山西太谷030801）

響應面法優化油棗中總黃酮的提取工藝

王爭爭1，2，楊慶文1，楊宇霞1，張 磊1，趙 欣1，李 慧1

（1.山西省生物研究所，山西太原030006；2.山西農業大學園藝學院，山西太谷030801）

在單因素試驗的基礎上，利用響應面法對影響油棗中總黃酮提取的3個主要因素，乙醇體積分數、料液比、提取溫度進行研究，利用Design Expert軟件對數據進行回歸分析，得到預測模型，并進行驗證。結果表明，該方法的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分數65%，料液比1∶50（g∶mL），提取溫度83℃，在此條件下油棗中總黃酮含量為6.70 mg/g。

油棗；總黃酮；提取工藝；響應面法

紅棗（Zizyphu jujube Dates），又名中華大棗、棗、華棗，是鼠李科棗屬植物棗樹（Zizyphu jujube M ill）的果實。紅棗在數千年廣泛栽培中，經過不斷選擇，演化出很多品種，其中油棗色深紅、油光發亮，個大、核小、肉厚、含糖高、含脂高，耐儲藏，營養價值高，豐產性能好[1-2]，為山西省十大名棗之一。隨著近幾年人們對紅棗功能成分和藥理的深入研究，發現紅棗中含有一些生物活性成分，如黃酮、多糖、三萜類化合物等[3]。其中黃酮類化合物有抗炎、抗病毒、利膽、強心、鎮靜鎮痛及抗氧化、清除自由基、抗衰老、免疫調節和抗腫瘤等諸多功效，已列為保健食品的一類功能因子[4-6]，因此對棗中的總黃酮進行提取研究具有很好的應用價值[7-9]。

響應面分析（response surface methodology，RSM）是利用合理的試驗設計，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應值之間的函數關系，通過分析回歸方程來求得最佳工藝參數[10]，是一種優化反應條件和加工工藝參數的有效方法[11]。它與正交試驗設計法相比，具有試驗周期短，得到的回歸方程精度高，可以研究多種因素間交互作用等優點[11-12]。

基于上述優點，本研究在單因素試驗的基礎上，采用響應面法對油棗中總黃酮的提取工藝進行優化，確定最佳提取工藝條件，為油棗的進一步開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油棗：產于山西省保德縣，烘干研磨，過60目篩，密封，置陰涼干燥處備用。

蘆丁對照品：中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇（分析純）：天津市光復科技發展有限公司；亞硝酸鈉（分析純）、氫氧化鈉（分析純）：北京化工廠；硝酸鋁（分析純）：天津市東麗區天大化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

UV-1601紫外可見分光光度計：北京瑞利分析儀器公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的建立

精密稱取干燥至質量恒定的蘆丁標準品10 mg，加體積分數為60%乙醇定容至25 m L，得質量濃度為0.4 mg/m L蘆丁標準溶液。準確吸取蘆丁標準溶液0、0.2 m L、0.4 m L、0.6 m L、0.8 m L、1.0 m L于10 m L比色管中，加入5%的亞硝酸鈉0.3m L，搖勻后放置6min，加入10%的硝酸鋁溶液0.3m L，搖勻后放置10 m in，加入4%的氫氧化鈉4 m L，用體積分數為60%乙醇定容，混勻后放置10 m in，于510 nm波長處測定吸光度值，參比為空白試劑[13]。

1.3.2 油棗中總黃酮的提取及含量測定

試驗采用乙醇回流熱提取法[12]對棗中的總黃酮進行提取。準確稱取0.5 g棗粉，定量加入一定體積分數的乙醇溶液，在一定溫度下浸提一定時間，離心后定容至50 m L，得待測樣品溶液。準確吸取上述待測液2 m L于10 m L比色管中按照1.3.1中方法進行比色，并用如下公式計算總黃酮含量。

式中：C為依據標準曲線查得被測液中總黃酮的質量濃度，mg/m L；V1為試樣處理后總定容體積，m L；V2為測定時樣液定容體積，m L；V3為測定用樣液體積，m L；m為稱取油棗粉的質量，g。

1.3.3 單因素試驗

（1）乙醇體積分數

準確稱取0.5g棗粉6份，分別加入體積分數為40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液25m L，于80℃水浴上回流提取60 min，離心后定容至50 m L，測定不同乙醇體積分數提取的樣品中的總黃酮含量。

（2）料液比

準確稱取0.5 g棗粉6份，分別加入5 m L、10 m L、15 m L、20 m L、25 m L、30 m L的體積分數為60%乙醇溶液，于80℃水浴上回流提取60 min，離心后定容至50 m L，測定不同料液比下所提取的樣品中的總黃酮含量。

（3）提取時間

準確稱取0.5 g棗粉6份，加入體積分數為60%的乙醇溶液25 m L，于80℃水浴上分別回流提取30 m in、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min，離心后定容至50 m L，測定不同提取時間所提取的樣品中的總黃酮含量。

（4）提取溫度

準確稱取0.5 g棗粉6份，加入體積分數為60%的乙醇溶液25 m L，分別于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃水浴上回流提取60 min，離心后定容至50 m L，測定不同溫度下提取的樣品中的總黃酮含量。

1.3.4 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，采用Design-Expert 8.0軟件中Box-Behnken試驗設計原理，選擇影響總黃酮提取量的3個主要因素：乙醇體積分數（A）、料液比（B）、提取溫度（C），以總黃酮提取量（Y）為響應值，設計3因素3水平的響應面分析試驗，因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.5 驗證性試驗

通過Design-Expert8.0軟件分析，對二次多項回歸方程模型得出的最佳條件進行驗證性實驗。

2 結果與分析

2.1 繪制標準曲線

按照1.3.1配制蘆丁標準溶液系列，以蘆丁質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制標準曲線，結果見圖1。由圖1可知，標準曲線回歸方程為y=12.493x-0.002 9，相關系數R2=0.999 7，表明二者線性關系良好。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 乙醇體積分數對油棗中總黃酮提取量的影響

圖2 乙醇體積分數對總黃酮提取量的影響Fig.2 Effects of ethanol content on total flavonoids extraction

由圖2可知，隨著乙醇體積分數的增加，油棗中總黃酮提取量先升高后下降，當乙醇體積分數達60%時，其總黃酮提取量達最大值6.422 mg/g，當乙醇體積分數再增加時，其總黃酮提取量下降，可能是由于總黃酮類化合物隨著乙醇含量增加，其溶解度降低，同時一些醇溶性物質、色素、親脂性強的成分溶出量增加，這些物質同總黃酮類化合物競爭同乙醇和水分子的結合，從而導致總黃酮提取量的下降[15]。因此，乙醇體積分數60%為宜。

圖3 不同料液比對總黃酮提取量的影響Fig.3 Effects of sdid-liquid ratio on total flavonoids extraction

2.3 料液比對油棗中總黃酮提取量的影響由圖3可知，隨著料液比的增大，油棗中總黃酮提取量的含量先增加后緩慢降低，當料液比為1∶50（g∶m L）時總黃酮提取量達最大值6.460 mg/g。這是因為提取劑較少時，黃酮溶出量不夠，而當擴散達到平衡時，提取劑量不會促進黃酮的提取，反而把其他物質溶出，在分離去除這些物質時可能帶走了少量黃酮所致。因此，料液比1∶50（g∶m L）較為適宜。

2.4 提取時間對油棗中總黃酮提取量的影響

圖4 不同提取時間對總黃酮提取量的影響Fig.4 Effects of extraction time on total flavonoids extraction

由圖4可知，隨著提取時間的增加，總黃酮的提取量呈增加趨勢，雖然在180 min時總黃酮提取量達到最大值6.460 mg/g，但在120 m in時總黃酮的提取量就達到了6.346 mg/g，從提取工藝的時間、周期、節約能源等角度考慮，提取時間120 min較為適宜。

2.5 提取溫度對油棗中總黃酮提取量的影響

由圖5可知，隨著提取溫度的升高，總黃酮的提取量先升高后趨于平緩，在80℃時總黃酮提取量達到一個最大值6.384 mg/g，90℃時略有降低。這是由于溫度的升高加速黃酮類物質的滲透、擴散、溶解速度等，使之更容易被提取出來，但過高的溫度會使黃酮類化合物氧化[10]。因此，提取溫度80℃為宜。

圖5 不同提取溫度對總黃酮提取量的影響Fig.5 Effects of extraction temperature on total flavonoids extraction

2.6 響應面試驗結果與分析

2.6.1 總黃酮提取響應面試驗方案及結果

在單因素試驗基礎上，固定提取時間為120min，以總黃酮提取量（Y）為響應值，對油棗中總黃酮提取工藝進行響應面分析，其具體試驗方案及結果見表2。運用Design-Expert 8.0軟件對試驗數據進行方差分析，結果見表3。

表2 響應面試驗方案及結果Table 2 Design and results of response surface experiments

以油棗中總黃酮含量（Y）為響應值，經回歸擬合后，各試驗因子對響應值的影響可用如下二元回歸方程表示：

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

該模型的決定系數R2=0.966 6，表示有96.66%的數據可用該模型解釋，說明方程可靠性較高。變異系數（coefficient of variation，CV）值越低說明試驗穩定性越好，本試驗的CV值為2.39%，說明試驗穩定性好，試驗操作可信。

由表3的方差分析結果看，模型的P值＜0.01（極顯著），表明模型充分擬合試驗數據，該方程是油棗中總黃酮含量與提取工藝參數的合適數學模型，能較好地起到預測作用。失擬項P值為0.112 9＞0.1（不顯著），表明試驗的誤差較小，未知因素對試驗干擾很少。P值越小說明對總黃酮含量影響越大，所以影響油棗中總黃酮含量的因素按影響大小排序依次為C（提取溫度）＞A（乙醇體積分數）＞B（料液比）。

2.6.2 響應面交互作用分析

通過Design-Expert 8.0軟件對各因素之間的交互作用進行響應面分析，繪制響應面曲線圖和等高線圖，結果見圖6。

圖6 乙醇體積分數、料液比和提取溫度的交互作用對總黃酮提取量的響應曲面和等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between ethanol concentration,liquid-solid ratio and extraction temperature on total flavonoids content

由圖6可知，隨著乙醇體積分數和料液比的增加，總黃酮提取量均先增加后降低，說明乙醇體積分數和料液比過高或過低都不能使總黃酮提取量達最大值，只有它們取到適中值時，才可能最大限度地提取油棗中的總黃酮。從等高線圖上看，幾乎呈圓形，表明乙醇體積分數與料液比交互作用不明顯，且圓形封閉，說明同時存在最大值。

總黃酮含量與乙醇體積分數呈明顯的二次拋物線關系，在60%左右出現峰值。根據相似相溶原理，油棗中總黃酮極性與此范圍的乙醇極性相當，因此在這一體積分數溶液中溶解性較好；總黃酮含量隨提取溫度增加顯著增加，但達到一定穩定后略有下降。從等高線圖上看，呈的橢圓形，表明乙醇體積分數與提取溫度交互作用較明顯，且橢圓形封閉，說明同時存在最大值。

總黃酮含量與料液比也呈明顯的二次拋物線關系，在料液比1∶50（g∶m L）左右出現峰值。從等高線圖上看，呈的橢圓形，表明料液比與提取溫度交互作用較明顯，且橢圓形封閉，說明同時存在最大值。

圖6可直觀地反映各因素交互作用對總黃酮得率和總黃酮含量的影響。圖中曲線越陡峭，表明該因子對油棗中總黃酮提取量的影響越大；反之，曲線越平滑，表明該因子對油棗中總黃酮提取量的影響較小。根據以上的數據分析表明油棗中總黃酮含量的交互影響順序為：AC＞BC＞AB。

2.7 油棗中總黃酮提取工藝條件的優化

經Design-Expert8.0軟件優化，油棗總黃酮最佳提取工藝條件為乙醇體積分數64.69%，料液比1∶50.33（g∶m L），提取溫度83.46℃，此時總黃酮提取量理論值達6.681 65 mg/g?？紤]到實際操作的可行性，將提取工藝條件修正為乙醇體積分數65%，料液比1∶50（g∶m L），提取溫度83℃。為驗證結果的可靠性，采用上述優化出的工藝參數進行3次平行試驗，得到油棗中總黃酮的實際提取量為6.70 mg/g，與理論預測值接近，表明建立的數學模型對油棗中總黃酮的提取具有實用價值。

3 結論

響應面分析法得到的油棗中總黃酮提取工藝條件為乙醇體積分數65%，料液比1∶50（g∶m L），提取溫度83℃。經過驗證試驗后，得到油棗中總黃酮的實際提取量為6.70 mg/g，與理論預測值接近，表明響應面法可以很好地對油棗中總黃酮提取工藝進行優化。

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Optimization of total flavonoids extraction process from Chinese jujube by response surface methodology

WANG Zhengzheng1,2,YANG Qingwen1,YANG Yuxia1,ZHANG Lei1,ZHAO Xin1,LI Hui1
(1.Shanxi Institute of Bio logy,Taiyuan 030006,China;2.College of Horticulture,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China)

On the basis of single factor tests,the factors of ethanol concentration,solid-liquid ratio and extraction temperature that affect total flavonoid extraction from Chinese jujube were studied by response surface methodology and the model was forecasted and analyzed with Design Expert software.The results showed that the optimum extraction conditions were obtained as follows:ethanol content 65%,solid-liquid ratio 1∶50(g∶m l), extraction temperature 83℃.Under this condition,the content of total flavonoids was 6.70 mg/g in Chinese jujube.

Chinese jujube;total flavonoids;extraction technology;response surface methodology

TS255.3

A

0254-5071（2015）03-0090-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.021

2015-02-06

山西科技攻關項目（20110311012-6）

王爭爭（1982-），女，助理研究員，博士研究生，研究方向為食品加工與安全。