食品中檸檬酸快速檢測試劑盒的研制

常平平，郝艷紅，周遵武，萬宇平*，劉 薇，錢 瑞，沈國棟

（1.北京勤邦生物技術有限公司，北京102206；2.山東春雪食品有限公司，山東萊陽265200）

食品中檸檬酸快速檢測試劑盒的研制

常平平1，郝艷紅1，周遵武2，萬宇平1*，劉 薇1，錢 瑞1，沈國棟1

（1.北京勤邦生物技術有限公司，北京102206；2.山東春雪食品有限公司，山東萊陽265200）

建立了一種酶法檢測食品中檸檬酸含量的快速檢測方法。將6 U L-蘋果酸脫氫酶、9.13 U L-乳酸脫氫酶、0.5 mg煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、2 mg硫酸鎂、3.783 mg海藻糖、5 mg聚乙二醇6000在0.2 mL 0.082 g/m L雙甘肽質量濃度下-60℃冷凍5 h，室溫條件下抽真空18 h得到試劑Ⅰ，0.468 U檸檬酸裂解酶在0.2 m L水體系冷凍干燥得到試劑Ⅱ。結果表明，該方法標準曲線線性關系良好，相關系數R2=0.995，線性范圍1～80 μg/L；靈敏度0.25 mg/L；檢測限0.5 mg/L；各樣品回收率均在90%～110%。該試劑盒方法可以在20 m in實現樣品中檸檬酸的快速檢測，方法靈敏度高、特異性高、快速簡便，適合于食品生產企業對食品中的檸檬酸進行快速檢測及對食品的質量和品質進行評價。

食品；檸檬酸；快速檢測試劑盒；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸

在食品生產過程中往往需要添加防腐劑、甜味劑、抗氧化劑、保鮮劑、人工合成色素等化學物質，它們的含量過高會對人體健康造成不利影響[1]。檸檬酸是有機酸中的第一大酸，由于其物理性能、化學性能、衍生物的性能，被廣泛應用于一些食品加工領域。檸檬酸的含量對食品的味道有很大影響，并且是某些食品品質的一項重要檢測指標，因此食品中檸檬酸的定性與定量分析對食品營養的研究意義重大，而且在食品生產過程的質量管理中也必不可少。目前，測定檸檬酸的方法有高效液相色譜法[2]、反相高效液相色譜法[3]、離子色譜法[4]、氣相色譜法[5]、毛細管電泳法[6-7]、微分電位溶出法[8]、阻抑動力學法[8]等。高效液相色譜法靈敏度較高，但是樣品前處理操作繁瑣，測定周期長、實驗成本高。離子色譜法由于淋洗液和柱填料的特殊性，對樣品中蛋白質含量有嚴格限定，不適合做復雜的樣品分析，而且柱子的容量小，進樣量不宜太多。因此，對于含有復雜成分的食品，不適合用此方法檢測檸檬酸的含量。氣相色譜法由于不宜揮發或熱不穩定的酸類在進樣之前往往需要進行衍生化反應，導致樣品的前處理比較困難且費時，成為氣相色譜檢測有機酸的瓶頸所在。毛細管電泳在靈敏度和重現性方面存在不足。酶法測定果汁中檸檬酸含量具有靈敏度高、專一性強、快速簡便的優點，酶法測定食品中檸檬酸的原理是：檸檬酸在酶的作用下裂解，其裂解產物通過還原型輔酶Ⅰ，即煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）被還原，然后通過測定吸光度值的降低來測量NADH的消耗量，即相當于檸檬酸的量。該方法不僅適用于果汁產品，還可以用于其他多種食品中檸檬酸含量的測定[10-11]。本實驗采用酶法測定果汁、茶飲料、水果、奶酪、啤酒、食用油等食品中檸檬酸的含量，并將NADH、L-蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，L-MDH）、L-乳酸脫2氫酶（L-lactic dehydrogenase，L-LDH）及相應的凍干保護劑凍干作為試劑Ⅰ，將檸檬酸裂解酶（citrate lyase，CL）及相應的保護劑凍干作為試劑Ⅱ進行試驗。凍干是復雜的相變過程，凍干制品在整個過程存在的各種應力，包括低溫應力、凍結應力、干燥應力等，常常是直接或間接導致制品中蛋白質變性的因素，所以在凍干過程中需使用保護劑。凍干保護劑一般可分為多羥基化合物、糖、氨基酸、蛋白質、聚合物和無機鹽等[12]，不僅要具有保護制品生物學活性的效果，而且要具有凍干賦形作用[13]，保護劑可改變生物樣品冷凍干燥時的物理、化學環境，減輕或防止冷凍干燥或復水對細胞的損害，盡可能保持原有的各種生理生化特性和生物活性[14-15]。本實驗建立了一種食品中檸檬酸的快速檢測方法，該方法對樣品的前處理簡單，靈敏度高、特異性高、檢測時間短，適合于食品生產企業對食品中的檸檬酸進行檢測及對食品的質量和品質進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

純果樂、茉莉蜜茶、紅茶、綠茶、橘子、橙子、固體奶酪、青島啤酒、魯花花生油均購自超市。檸檬酸脫氫酶（C0897-100 UN）、L-蘋果酸脫氫酶（M 1567-5 kU）、L-乳酸脫氫酶（L-2625-2.5 kU）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（N2630-50 mg）、雙甘肽（G1002-25 g）、谷胱甘肽（G2299-100 g）、半胱氨酸（純度97%）：美國Sigma公司；檸檬酸、七水硫酸鎂、海藻糖、聚乙二醇2000、聚乙二醇6000、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、鹽酸、咪唑、三羥甲基氨基甲烷、甘油、乙二胺四乙酸二鈉、L-酒石酸、甘露醇、硫酸銨、三氯乙酸和β-巰基乙醇均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UVmini-1240紫外分光光度計：島津企業管理（中國）有限公司；QL-901渦旋儀：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；LGJ-18A冷凍干燥機：北京四環科學儀器廠有限公司；XP205分析天平：梅特勒-托利多國際股份有限公司；SpS2001F電子天平：龍騰電子有限公司；PHS-3E pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 凍干方式

各試劑單獨凍干保護劑的篩選：分類別進行凍干保護劑篩選，多羥基化合物（甘露醇、酒石酸）、糖類（蔗糖、海藻糖、葡萄糖）、氨基酸（谷胱甘肽、半胱氨酸）、聚合物（聚乙二醇2000、聚乙二醇6000），調整保護劑的濃度對NADH、L-MDH、L-LDH、CL分別進行凍干。凍干前均進行可行性驗證，所加保護劑不影響實驗結果的條件下進行凍干實驗，凍干取出后即進行吸光度值測定，并進行保存性跟蹤。

試劑混合凍干保護劑及凍干體系的篩選：將NADH和L-LDH混合、NADH、L-MDH和L-LDH混合進行凍干，篩選凍干保護劑及凍干體系。

1.3.2 標準曲線制作

在5個10 m L的容量瓶中，分別準確的加入0.40 m g/m L檸檬酸標準溶液0、0.10 m L、0.20 m L、0.50 m L、1.00 m L，用蒸餾水定容至刻度，混勻放置10 min。分別取各標準溶液0.20 m L，加入1.80 m L純水，1 m L用水復溶的試劑Ⅰ，同時做一組空白實驗，即取2.00 m L純水、1 m L用水復溶的試劑Ⅰ，混勻后靜置10m in，在波長340 nm處測定吸光度值A1，加入用0.02 m L水復溶的試劑Ⅱ，混勻后靜置10 min，測定吸光度值A2。

1.3.3 樣品的前處理

針對不同的樣品進行不同的處理，具體樣品前處理方法見表1。

表1 樣品前處理方法Table 1 Pretreatment methods of samples

1.3.4 各類樣品中檸檬酸回收率的測定

在合適的稀釋倍數下對樣品進行測定，在該稀釋倍數下對樣品進行0.5倍、1.0倍、2.0倍檸檬酸標準溶液質量濃度的添加，測定并計算回收率。

2 結果與分析

2.1 L-MDH、L-LDH、NADH單獨及混合凍干保護劑的篩選

將試劑Ⅰ中NADH、L-MDH、L-LDH單獨分別在200 μL保護劑甘露醇、酒石酸、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、谷胱甘肽、半胱氨酸、聚乙二醇2000、聚乙二醇6000等不同物質下進行凍干，凍干前后對同一濃度檸檬酸標準溶液進行測定，測定吸光度差值ΔA［ΔA=（A2-A1）標準-（A2-A1）空白］無明顯差異，且隨著保存時間延長，吸光度差值變化不大，則凍干保護劑效果良好；凍干后粉劑無明顯氣泡，規則易于復溶解則凍干保護劑效果良好；凍干后保存時間越長，凍干保護劑效果越優。

單獨凍干保護劑篩選結果見表2，混合凍干保護劑篩選結果見表3。

表2 單獨凍干保護劑種類、凍干后形態、凍干后保存性Table 2 Species of single cryoprotectant working reagents, lyophilized forms and preserving qualities

由表2可知，各濃度海藻糖、0.164 g/m L及0.082 g/m L雙甘肽、硫酸鎂、聚乙二醇6000作為保護劑的各試劑在凍干取出后形態較為規則，且保存時間相對較長，在保存中吸光度差值降低較緩慢，試劑Ⅱ（CL）在200 μL水體系下無需凍干保護劑凍干后在4℃保存3個月測定吸光度差值及形態均良好。

由表3可知，3.783 mg海藻糖+2 mg硫酸鎂+5 mg PEG6000+0.082 g/m L雙甘肽200 μL作為保護劑凍干NADH、MDH、L-LDH混合劑后保存性良好。該體系凍干后在4℃保存3個月測定無明顯差異。由于NADH見光遇熱氧化，凍干后的試劑需要避光低溫保存，且凍干程度及后期的密封性均會影響試劑保存性。

表3 試劑混合凍干保護劑種類篩選、凍干后形態、凍干后保存性Table 3 Species screening of cryoprotectant mixture reagents, lyophilized forms and preserving qualities

2.2 檸檬酸標準曲線的繪制

以吸光度差值ΔA（y）為縱坐標［ΔA=（A2-A1）標準-（A2-A1）空白］，檸檬酸含量（x）為橫坐標，繪制標準曲線見圖1。

圖1 檸檬酸標準曲線Fig.1 Standard curve of citric acid

由圖1可知，標準曲線線性回歸方程為y=0.051x-0.001 3，相關系數R2=0.995，表明二者在1～80 μg/L內線性相關。分光光度計在波長340 nm條件下測定的檸檬酸質量濃度（靈敏度）為0.25 mg/L，檢測限為0.5 mg/L。

2.3 樣品中檸檬酸回收率實驗

對不同樣本進行回收率測定時，加入檸檬酸標準品后的體積均為0.4 m L，樣品中回收率實驗結果見表4。

表4 加標樣品中檸檬酸的回收率Table 4 Recovery rates of citric acid sam ples

續表

由表4可知，各樣品回收率均在90%～110%，表明該方法準確度較好。

3 結論

將NADH、L-MDH、L-LDH及硫酸鎂、海藻糖、聚乙二醇6000、雙甘肽等凍干保護劑混合凍干作為試劑Ⅰ，將水體系的CL凍干作為試劑Ⅱ。利用標準曲線可推算出樣品中檸檬酸含量。該方法的檢測線性范圍為1～80 μg/L，靈敏度為0.25 mg/L，檢測限為0.5 mg/L，測定的各樣品回收率均在90%～110%；試劑盒方法可以在20 m in實現樣品中檸檬酸的快速檢測，適合樣品的批量檢測。

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Development of rapid detection kit for citric acid in food

CHANG Pingping1,HAO Yanhong1,ZHOU Zunwu2,WAN Yuping1*,LIU Wei1,QIAN Rui1,SHEN Guodong1
(1.Beijing K winbon Biotechnology Co.,Ltd.,Beijing 102206,China;2.Shandong Spring Snow Food Co.,Ltd.,Laiyang 265200,China)

s:A rapid enzymatic detection method was developed for determination of citric acid in food.Reagent I was made by L-malate dehydrogenase 6 U,L-lactate dehydrogenase 9.13 U,nicotinamide adenine dinucleotide 0.5 mg,MgSO42 mg,trehalose 3.783 mg,PEG 6000 5 mg with 0.082 g/m l Gly-Gly 0.2 m l after freezing 5 h at-60℃,and then vacuumized for 18 h at room temperature.Reagent II was made by citrate lyase 0.468 U in 0.2 m l water system by freeze drying.Results showed the correlation coefficient of standard curve was 0.995,linearity range was 1-80 μg/L,the sensitivity of method was 0.25 mg/L,the limit of detection of method was 0.5 mg/L,and the recovery rate was 90%-110%.By this method,the citrate in the sample can be rapidly detected within 20 m in.The method was simple and fast with high sensitivity and specificity,which was suitable for rapid detection of citric acid in food and evaluation of food quality.

food;citric acid;rapid detection kit;nicotinamide adenine dinucleotide

TS207.3

A

0254-5071（2015）03-0111-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.026

2015-01-07

科技新星計劃（Z141105001814116）

常平平（1984-），女，工程師，碩士，研究方向為食品分析與檢測。

*通訊作者：萬宇平（1982-），男，工程師，碩士，研究方向為食品安全檢測技術研究。