固態發酵食醋生產過程中主要微生物及風味生成的探討

蘇迎會

（河北保定槐茂有限公司，河北保定071011）

固態發酵食醋生產過程中主要微生物及風味生成的探討

蘇迎會

（河北保定槐茂有限公司，河北保定071011）

實驗研究了不同時間、不同醋醅層次的微生物分布和數量變化規律，探索影響風味形成的因素。結果表明，發酵前5 d，酵母菌和乳酸菌迅速增殖，第5天酵母菌數達到最高3.4×107CFU/g，乳酸菌最高為3.2×107CFU/g，以乳酸為主的不揮發酸同時也生成較快；醋酸菌前3 d增長迅速，之后緩慢增長并以生成揮發性的醋酸為主，第11天醋酸菌數量達到峰值為4.0×107CFU/g，13 d以后逐漸消亡。醋酸發酵初期，pH值迅速下降，不揮發酸迅速增加，不揮發酸占總酸的比值最大在第7天，為87.22%；總酸在發酵中期的7～13 d增幅最大。乳酸菌的消長影響著不揮發酸的生成，醋酸菌的消長影響著總酸的生成，醋酸發酵過程中控制合適的發酵條件，使兩者的相互協調生長，有利于產品口感風味的調和。

釀造食醋；酵母菌；醋酸菌；乳酸菌；風味

釀造食醋是指單獨或混合使用各種含有淀粉、糖的物料或酒精，經微生物發酵釀制而成的液體調味品[1]。食醋作為酸性調味品，其中的主要成分是酸性物質，通常稱為總酸，食醋中的酸類成分又以醋酸為主，其他的不揮發有機酸類物質以乳酸為主，還有少量的琥珀酸、酒石酸、葡萄糖酸、檸檬酸等。除有機酸類外，食醋中還含有糖類、氨基酸類以及少量和微量的醇類、醛類、酚類、酮類[2]。這些物質共同存在于食醋中，各成分之間相互作用，共同構成了食醋的風味和口感，使其酸味柔和、鮮美、醇厚。

在固態發酵食醋生產工藝中，其影響風味及口感的因素很多，如釀造工藝、原料的選擇、原料配比以及淀粉含量、醋醅水分含量、參與發酵的微生物種類及酶系、發酵階段生化反應控制條件、發酵過程醋醅溶氧或厭氧條件、發酵溫度以及生產環境衛生條件等。

食醋釀造是多種微生物共同作用的過程，主要微生物為霉菌、酵母菌、醋酸菌和乳酸菌[3]。食醋發酵過程分為淀粉糖化、酒精發酵和醋酸發酵3個階段，期間有不同種類的微生物生長繁殖并產生各種酶類，對食醋原料進行分解利用，經過一系列復雜的生物化學變化最終形成食醋。本試驗對固態發酵過程中微生物的生長變化規律進行研究，同時檢測發酵過程中醪液的pH值、總酸及不揮發酸，探索各指標與風味形成的關系，對固態發酵食醋工藝條件及生產控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

碎米、麩皮、稻殼、食鹽：市售；耐高溫α-淀粉酶（酶活力20 000 U/m L）、糖化酶（酶活力100 000 U/m L）：棗莊市杰諾生物酶有限公司；活性干酵母：廣東丹保利酵母有限公司。

酵母菌培養基采用孟加拉紅培養基[4]：蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、磷酸二氫鉀1 g、無水硫酸鎂0.5 g、瓊脂20 g、孟加拉紅0.033 g、氯霉素0.1 g、蒸餾水1 000 m L。

乳酸菌培養基采用MRS培養基[5]：蛋白胨10 g、牛肉粉5 g、酵母粉4 g、葡萄糖20 g、吐溫-80 1 m L、K2HPO4·7H2O 2 g、三水醋酸鈉5 g、檸檬酸三銨2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·4H2O 0.05 g、瓊脂粉15 g、水1 000 m L、pH 6.2。

醋酸菌培養基[6]：1%酵母膏、1%葡萄糖、2.5%瓊脂、滅菌后加入1%無菌CaCO3、4%無水乙醇。

蛋白胨：北京雙旋微生物培養基制品廠；酵母粉、瓊脂、CaCO3：北京化學試劑公司。

葡萄糖（分析純）、無水乙醇（分析純）：天津市北方天醫化學試劑廠；磷酸二氫鉀（分析純）：北京紅星化工廠；無水硫酸鎂（分析純）：天津市化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

醋酸發酵池（13 m×1.5 m×1.5 m）：河北保定槐茂有限公司自制；PB-20酸度計：北京賽多利斯有限公司；LRH-250A生化培養箱：廣東省醫療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 采樣方法

酒精發酵結束后，進入醋酸發酵階段，每天翻醅。每隔3 d取樣一次，檢測醋酸發酵階段食醋中各理化指標（pH值[7]、總酸[8]及不揮發酸[1]）的變化情況。

酒精發酵結束后，酒醪與輔料混合入池，采用自然界中的醋酸菌，每天進行翻醅。每隔2 d取樣一次，分別取上、中、下層的醋醅，采用無菌操作，各取樣200 g，分別在酵母菌培養基、乳酸菌培養基、醋酸菌培養基上培養酵母菌、乳酸菌、醋酸菌，培養后分別計數，檢測醋酸發酵階段醋醅中微生物的變化情況。

醋酸發酵21 d時，根據工藝的需要，采取加鹽處理，主要是防止過氧化的現象產生。加鹽抑制各種菌的生長，故不再進行檢測。但是各種菌的酶系依然存在于醋醅中，其理化指標會產生小幅的變化，故將理化指標檢測到醋酸發酵結束，即27 d時。

1.3.2 測定方法

總酸測定采用GB/T 12456—2008《食品中總酸測定》中的方法；pH值測定采用酸度計法；不揮發酸的測定采用GB 18187—2000《釀造食醋》中的方法。

微生物計數采用稀釋平板法。酵母菌于28℃培養5 d后計數，乳酸菌36℃厭氧培養（48±2）h后計數，醋酸菌30℃培養72 h后計數。

2 結果與分析

2.1 醋酸發酵階段微生物的變化情況

不同發酵時間不同層次上醋醅中主要微生物的數量見表1。

2.1.1 醋酸發酵過程中酵母菌數量變化趨勢

醋醅各層次酵母菌隨發酵時間的變化如圖1所示。由圖1可以看出，在整個發酵過程中酵母菌數量呈現先快速升高后緩慢降低的趨勢且在不同層次上隨著深度增加而減少。上層酵母菌增長速度快并且數量高于中層和下層菌。發酵前期醋醅溫度較低，在26～29℃，淀粉糖化階段提供較高的糖源，有利于酵母菌自身繁殖，第5天上層酵母菌數達到最高3.4×107CFU/g，由于溶解氧的存在，上層菌增殖速度要高于中層及下層菌。隨著醋醅中氧氣的耗盡，厭氧環境下酵母菌基本停止繁殖而主要進行酒精發酵作用，酒精逐漸增多，產生大量CO2使醋醅溫度升高，同時醋酸菌利用酒精進行醋酸發酵，酒精的增多以及酸的產生不適宜酵母的生長繁殖，因此在第7天以后隨發酵時間延長，酵母菌的數量呈減低趨勢。

2.1.2 醋酸發酵過程中乳酸菌數量變化趨勢

醋醅各層次乳酸菌隨發酵時間的變化情況如圖2所示。由圖2可知，在發酵過程中乳酸菌數量總體呈現先升高后減少的趨勢。中層乳酸菌數量在第5天最先達到峰值為3.2×107CFU/g，上層菌第11天達到最多為6.0×106CFU/g，下層菌第11天數量最多為1.8×107CFU/g。乳酸菌與醋酸菌同屬細菌，微耗氧到厭氧，主要發酵糖類產生乳酸，少量產生乙酸，醋醅發酵前期1～5 d主要為酒化階段，厭氧條件下乳酸菌生長繁殖并產生大量乳酸，醋酸菌也產生少量醋酸，中層菌在較低含量氧氣環境下最先達到峰值。通過每天翻醅，隨后上層和中層乳酸菌產酸速率開始減慢，醋酸菌產酸速率提高，而醋醅底層的乳酸菌通過厭氧發酵繼續產生一定量的乳酸。隨著醋醅營養物質的減少，乙酸持續生成，醋醅pH下降，最終使乳酸菌數量下降。

圖2 乳酸菌數量變化曲線Fig.2 Changing curve of lactic acid bacteria count

醋酸發酵初期醋醅處于弱酸性，醅料中溶氧量較少，適合乳酸菌的生長繁殖，乳酸菌利用較簡單的碳水化合物糖類生成乳酸，隨著發酵時間的延長，醋醅下層的無氧條件為乳酸菌提供了生長的場所。

2.1.3 醋酸發酵過程中醋酸菌數量變化趨勢

醋醅各層次醋酸菌隨發酵時間的變化如圖3所示。由圖3可以看出，在發酵過程中醋酸菌的變化趨勢為是先上升后下降，中間水平階段持續時間較長。第11天上層醋酸菌數量達到峰值為4.0×107CFU/g，中層和下層菌數量略低于上層。發酵前期醋醅中含有豐富的糖源，隨著酵母菌發酵作用的進行，空氣中醋酸菌逐漸進入醋醅中并開始生長繁殖。醋酸菌產酸是耗氧的，在經過短暫增殖過程后，醋酸菌進入發酵產酸階段，醋酸菌數量不再繼續增長。醋醅中微生物的活動不是單獨進行的，酵母菌利用糖類產酒精的同時，醋酸菌在適宜的條件下氧化酒精最終生成乙酸，隨著酒精含量的減少，醋酸濃度升高、醋醅pH值降低，這些條件都會抑制醋酸菌的生長。酸度不再上升即酒精氧化將完時，加入食鹽并壓實醋醅能抑制醋酸菌繁殖與發酵，防止醋酸分解，即進入后熟期。

圖3 醋酸菌數量變化曲線Fig.3 Changing curve of acetic bacteria count

醋醅不同層次上醋酸菌數量無太大變化，下層略低，翻醅一方面是為了使整個醋醅微生物分配均勻，另一方面防止由于多種微生物共同作用導致中上層局部溫度過高而造成燒醅。耐酸耐酒精等優勢醋酸菌利用醋醅中充足的營養條件進入發酵環境并開始作用，發酵后期下層酸度高因此增加了醋酸菌的消亡速度。

2.2 醋酸發酵階段各理化指標的變化情況

醋酸發酵階段，食醋中pH值、總酸及不揮發酸的變化情況，其結果見表2。

由表2可知，醋酸發酵前期（1～7 d），pH值迅速降低，pH值從4.55降至3.94?？偹岷筒粨]發酸都迅速增加，不揮發酸占總酸的比值第7天達到最大，為87.22%，也就是以乳酸為主的不揮發酸的增加幅度更大。隨著發酵天數的延長，總酸不斷的增加，在發酵最旺盛的7～13 d增幅最大，由3.13%增加至5.37%，平均每天增加0.37%，而pH值和不揮發酸在此階段卻變化不大。發酵前期，乳酸菌利用較簡單的碳水化合物糖類生成乳酸，使不揮發酸迅速增加。酵母菌將糖類轉成酒精，底物減少，不揮發酸增長減少。同時，醋酸菌利用酒精生成醋酸加快，總酸在7～13 d時迅速增加。隨著發酵時間的延長，醋液中各種物質（酸類、含氮物質、糖類、醇類、醛類以及微量的離子物質等微量元素）成分含量及種類越來越多，這些物質的存在構成了醋液的緩沖體系，醋液中的有效成分越多，其緩沖范圍越大，pH值變化就不明顯了。同時pH值越低，食醋的風味口感越有刺激性，反而則食醋的風味口感就越加柔和醇厚。不揮發酸是大分子的有機酸，其口味無刺激性，在總酸中占30%時，產品口感柔和、醋香濃郁，若比值偏小，則醋酸刺激味強，若比值偏大，則醋香氣不濃郁。

表2 醋酸發酵階段pH值、總酸及不揮發酸的變化Table 2 pH value,total acid and non-volatile acid changes during acetic acid fermentation

3 結論

固態發酵作為傳統食醋發酵工藝，是多種微生物共同作用、生化反應復雜的工藝過程。酵母菌、乳酸菌和醋酸菌整體呈現先增長后逐漸消亡的趨勢。酵母菌前期快速增長，第5天達到最高3.4×107CFU/g，酵母菌主要作用為在缺氧的條件下分解糖類物質產生酒精，所以此階段應將料溫控制在30℃左右；乳酸菌在第5天時達到最高數量為3.2×107CFU/g，作用緩慢持續時間較長，以產乳酸為主，乳酸和醋液中的糖類、酯類等大分子物質，共同增加食醋的醇厚柔和口感；醋酸菌為醋醅中的優勢菌，第11天達到最高為4.0×107CFU/g，自始至終發揮著重要的作用，將乙醇氧化成乙酸，決定著食醋的產率。

總酸生成得越高，產品的產率也就越高，但是只有當不揮發酸占總酸的比值在一定的范圍內時，食醋產品口感柔和、醋香濃郁。乳酸菌的消長影響著不揮發酸的生成，醋酸菌的消長影響著總酸的生成，醋酸發酵過程中控制合適的發酵條件，使兩者相互協調生長，有利于產品口感風味的調和。

[1]中華人民共和國衛生部，中國國家標準化管理委員會.GB 18187—2000釀造食醋[S].北京：中國標準出版社，2000.

[2]王貴雙，高麗華，趙俊平，等.釀造食醋與配制食醋中有機酸的分析研究[J].中國釀造，2011，30（11）：152-154.

[3]董勝利，徐開生.釀造調味品生產技術[M].北京：化學工業出版社，2003.

[4]中華人民共和國衛生部，中國國家標準化管理委員會.GB 4789.15—2010食品微生物學檢驗霉菌和酵母菌檢驗[S].北京：中國標準出版社，2010.

[5]中華人民共和國衛生部，中國國家標準化管理委員會.GB 4789.35—2010食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗[S].北京：中國標準出版社，2010.

[6]劉曉棟，佘躍惠，張鴻翼.醋酸菌培養條件研究[J].化學工程師，2007，136（1）：17-19.

[7]王歡，盧紅梅，張義明，等.固態發酵食醋中還原糖、總糖含量測定[J].中國釀造，2011，30（9）：176-179.

[8]中華人民共和國衛生部，中國國家標準化管理委員會.GB 5009.41—2003食醋衛生標準的分析方法[S].北京：中國標準出版社，2003.

[9]許偉，張曉君，許泓瑜，等.鎮江香醋醋酸發酵過程中細菌群落組成分析[J].微生物學通報，2007，34（4）：646-649.

[10]吳榮榮，張志民，張煜行，等.黑曲霉M 2固態發酵產液化酶和糖化酶的研究[J].中國釀造，2012，31（1）：112-115.

[11]蔡美珠.應重視乳酸菌在食醋中的作用[J].中國釀造，1992，11（4）：10-12.

[12]上海市釀造科學研究所編著.發酵調味品生產技術（修訂版）[M].北京：中國輕工業出版社，1998.

[13]周德慶.微生物學教程[M].北京：高等教育出版社，2002.

[14]徐巖譯.發酵食品微生物學[M].北京：中國輕工業出版社，2001.

[15]黃中華，田元蘭，廖鴻生，等.中國調味食品技術實用手冊[M].北京：中國標準出版社，1991.

Microorganisms and flavor formation in vinegar production with solid-state fermentation

SU Yinghui
(Hebei Baoding Huai Mao Co.,Ltd.,Baoding 071011,China)

The microbial distribution and quantity changes in different layers of vinegar fermented grains at different time were studied,and the factors affecting flavors formation were discussed.Results showed that yeast and lactic acid bacteria rapidly proliferated in the first five days,at the fifth day, the yeast count reached the highest of 3.4×107CFU/g,lactic acid bacteria was the highest of 3.2×107CFU/g,non-volatile acid(mainly lactic acid) generated fast.The acetic acid bacteria rapidly proliferated in the first three days,whereafter,it increased slow ly and mainly produced acetic acid.At the eleventh day,the number of acetic acid bacteria reached a peak of 4.0×107CFU/g,and then decreased after thirteen days.At the beginning of acetic acid fermentation,the pH value decreased rapidly,but non-volatile acid increased rapidly,and the maximum ratio of non-volatile acid accounted for the ratio of the total acid was acquired at the seventh day,which was 87.22%.The grow ing rate of total acid during 7-13 d of medium fermentation stage increased maximally.The grow th of lactic acid bacteria affected non-volatile acids generation,the growth of acetic acid bacteria affected total acid generation.Suitable fermentation conditions control during acetic fermentation could coordinate their grow th and reconcile the taste.

fermented vinegar;yeast;acetic acid bacteria;lactic acid bacteria;flavor

TS264.2

A

0254-5071（2015）03-0137-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.033

2014-11-24

蘇迎會（1975-），女，高級工程師，本科，研究方向為調味品釀造技術及新產品開發。