紅茶菌固定化發酵葛根茶飲料工藝研究

王潤東，邵 偉

（1.湖北智慧果林業科技有限公司技術中心，湖北興山443700；2.三峽大學生物與制藥學院，湖北宜昌443001）

紅茶菌固定化發酵葛根茶飲料工藝研究

王潤東1，邵 偉2*

（1.湖北智慧果林業科技有限公司技術中心，湖北興山443700；2.三峽大學生物與制藥學院，湖北宜昌443001）

以葛根纖維提取物為原料進行紅茶菌發酵，并以發酵茶中的總酸含量、總糖利用率和對發酵液的感官評價分作為評價指標，探討了蔗糖添加量、接種量、揺瓶轉速和發酵時間等因素對固定化細胞技術發酵葛根茶飲料的影響，并通過正交試驗優化了發酵葛根茶飲料的最佳工藝條件。結果表明，蔗糖添加量為70 g/L，接種量為8%，揺瓶轉速為180 r/min，發酵時間為7 d，所制得的發酵葛根茶飲料色澤均勻，酸甜可口。

葛根；紅茶菌；固定化；發酵；飲料

葛根（Pueraria lobota）為藤本植物葛的塊根，莖被稀疏的棕色長硬毛，是我國南方一些省區的一種藥食兩用植物，其味甘涼可口，常作煲湯之用。其主要成分是淀粉，此外還含有約12%的黃酮類化合物，包括大豆（黃豆）甙、大豆甙元、葛根素等10余種；并含有胡蘿卜甙、氨基酸、香豆素類等[1-5]。葛根在提取完淀粉后，其葛根纖維渣多半丟棄，造成環境的污染，而其中也含有大量的有益成分，若能加以利用則有益于葛根產業的良性發展。

近年來，紅茶菌飲料在世界各國都頗受歡迎，它主要由醋酸菌、乳酸菌等多種微生物共同對糖茶水進行發酵而成[6-10]。目前，紅茶菌大都是采用靜置培養的方式，這種方式易受雜菌污染，培養條件要求較高，菌種不宜保藏等。固定化技術是將酶或細胞固定于一定范圍內，使它們既保持原有的活性，又可以在連續反應后回收并實現重復利用的一項技術[11]。同游離細胞相比，細胞經固定化后在單位體積內細胞濃度大幅度增加，提高發酵速率；其次，固定化細胞發酵性能穩定；再者，細胞固定后可以重復利用，對于生產胞外產品的發酵簡化了細胞分離的步驟，節約了發酵過程的生產成本[12]。

本研究將葛根纖維渣中的有益成分進行抽提，以固定化細胞技術發酵葛根茶飲料，不僅可解決游離菌混合靜置發酵生產紅茶菌時存在的弊端，而且這種發酵方式有助于控制產品的質量，對葛根發酵茶飲料的開發具有一定的指導意義，從而為發酵葛根茶飲料的工業化生產提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛根纖維渣：湖北智慧果林業科技發展有限公司；紅茶菌：由三峽大學微生物實驗室提供并保藏；白砂糖：市售。

海藻酸鈉、明膠均為化學純，其他試劑均為分析純：國藥集團藥業股份有限公司。

紅茶菌活化培養基的制備：蔗糖10 g，酵母膏10 g，碳酸鈣15 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 000 m L，pH 6.8，121℃滅菌20 min，培養基冷卻至50℃左右，加入5%的無水乙醇。

發酵葛根茶飲料培養基的制備：將30g葛根纖維渣加入到1000m L沸水中，浸提60min，再將一定量的蔗糖（70g/L）加入到茶液中，混勻溶解，200目濾網過濾，得濾液，加水補足1 000m L，分裝至三角瓶中，裝液量為120 m L/250 m L，巴氏消毒（85℃、10 min），冷至室溫備用。

1.2 儀器與設備

ALC-210.4型電子天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司；BXM-30R全自動立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊醫療器械有限公司；L550低速離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；ZD85-1振蕩培養器：蘇州國華科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵葛根茶飲料加工工藝流程

1.3.2 操作要點

（1）固定化紅茶菌細胞的制備[13]

將5.5%的海藻酸鈉和1.5%的明膠充分溶解，滅菌后待其溫度降至室溫時，將培養好的紅茶菌懸液與等體積的固定化載體溶液充分混勻，混勻后的紅茶菌混合液用注射器滴入0.6%的氯化鈣溶液中，得到固定化紅茶菌細胞顆粒，固定1 h后用無菌水沖洗，重新加入0.6%的氯化鈣溶液，4℃平衡過夜，備用。

（2）發酵葛根茶飲料的制備

按8%接種量向裝液量為120 m L/250 m L的發酵葛根茶飲料培養基中接入固定化紅茶菌細胞顆粒，30℃、180 r/min振蕩培養7 d，發酵結束后，用200目濾網過濾發酵液，濾液裝瓶后進行巴氏消毒（85℃、10 min），冷卻后即為成品。

1.3.3 發酵工藝優化單因素試驗

以總酸含量、總糖利用率及感官評分為考察指標，分別考察蔗糖添加量（50 g/L、60 g/L、70 g/L、80 g/L、90 g/L、100 g/L），接種量（2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%），搖瓶轉速（100 r/m in、120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/m in、200 r/m in、220 r/m in），發酵時間（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h）等因素對發酵葛根茶飲料品質的影響。

1.3.4 固定化發酵工藝條件優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，進行正交試驗，選擇蔗糖添加量（A）、接種量（B）、揺瓶轉速（C）和發酵時間（D）等4個因素，每個因素選取3個水平，以感官評分為評價指標，按L9（34）正交表設計試驗，因素與水平見表1。

表1 發酵工藝優化正交試驗因素與水平Table1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation technology optimization

1.3.5 測定方法

在葛根茶飲料發酵過程中，每隔一天分別測定發酵液的總酸含量、總糖利用率，并對成品進行感官評價，以此分析各因素對葛根茶發酵飲料品質的影響。

（1）總酸的測定

采用國標GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中酸堿滴定法。

（2）總糖利用率的測定

采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定蔗糖含量[14]?？偺抢寐视嬎愎饺缦拢?/p>

（3）發酵葛根茶飲料感官評價[15]

組織10人為感官評價小組，根據表2的評價標準，對不同產品的色澤、風味進行鑒定并打分，滿分為4分，以感官評分平均值作為最終的感官評價結果。

表2 發酵葛根茶飲料感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of fermentation kudzu root beverage

2 結果與分析

2.1 蔗糖添加量對發酵葛根茶飲料的影響

由圖1可知，隨著蔗糖添加量的增加，發酵液的總糖利用率呈現先升后降的趨勢，當蔗糖添加量為80 g/L時，發酵液的總糖利用率最大，而隨著蔗糖添加量的增加，發酵液中的總酸含量總體呈現下降的趨勢，由此可見蔗糖添加量越大，對紅茶菌的抑制作用越強，總酸含量越低。因此，初步確定發酵葛根茶飲料培養基中蔗糖添加量為60～90 g/L。

圖1 蔗糖添加量對總酸含量和總糖利用率的影響Fig.1 Effect of sucrose addition on total acid content and total sugar utilization

表3 蔗糖添加量對感官評分的影響Table 3 Effect of sucrose addition on sensory evaluation score

由表3可知，隨著蔗糖添加量的增加，感官評分呈現先升后降的趨勢，這是因為蔗糖添加量過低或過高，會導致發酵液偏酸或偏甜，而當蔗糖添加量為70～80 g/L時，發酵液酸甜可口，感官評價分值最高。

2.2 接種量對發酵葛根茶飲料的影響

圖2 接種量對總酸含量和總糖利用率的影響Fig.2 Effect of inoculum on total acid content and total sugar utilization

由圖2可知，隨著接種量的增加，發酵液的總酸含量和總糖利用率均不斷增加，但接種量在10%～15%時發酵液的總酸含量差別不大，這是由于接種量過大時，醋酸菌會大量消耗發酵液中的營養物質用于其自身的生長、繁殖，并代謝大量的廢物。同時，接種量＞10%時，發酵液中總酸含量過大，影響發酵液品質，而接種量為2.5%時，發酵不徹底，發酵液的總酸含量僅為5.43 g/L，這說明接種量過高或過低，都不利于葛根茶飲料的發酵。因此，初步確定接種量為6%～10%。

表4 接種量對感官評分的影響Table 4 Effect of inoculum on sensory evaluation score

由表4可知，隨著接種量的增加，感官評價分值呈現先升后降的趨勢，當接種量為8%時，感官評分最高，這說明8%的接種量有益于發酵葛根茶飲料的品質。

圖3 搖瓶轉速對總酸含量和總糖利用率的影響Fig.3 Effect of shaking speed on total acid content and total sugar utilization

2.3 搖瓶轉速對發酵葛根茶飲料的影響

由圖3可見，隨著搖瓶轉速的增加，發酵液的總酸含量和總糖利用率均不斷提高，這是由于轉速的提高有利于氧在發酵液中的溶解，使發酵液中的糖分更易于轉化為醋酸，但轉速達到200 r/min后，其對溶氧的貢獻達到了極限，出現了發酵液中總酸含量和總糖利用率增加緩慢的現象，這說明一定的搖瓶轉速對葛根茶飲料的發酵是有益的。因此，初步確定搖瓶轉速為140～200 r/min。

表5 搖瓶轉速對感官評分的影響Table 5 Effect of shaking speed on sensory evaluation score

由表5可知，隨著搖瓶轉速的增加，感官評價分值呈現先升后降的趨勢，當搖瓶轉速為180 r/min時，感官評價分最高，這說明采用180 r/min的搖瓶轉速制得的發酵葛根茶飲料品質較好。

2.4 發酵時間對發酵葛根茶飲料的影響

由圖4可知，隨著發酵進行，發酵液中總酸含量和總糖利用率隨發酵時間的延長均呈同步增長趨勢，這是因為發酵葛根茶飲料中的紅茶菌生長繁殖不僅需要消耗糖類物質，而且乙酸、乙醇等產物的生成也需要通過糖類物質的轉化。到發酵的第7天時，發酵液中總酸含量為14.2g/L。因此，初步確定搖瓶發酵時間為6～8 d。

圖4 發酵時間對總酸含量和總糖利用率的影響Fig.4 Effect of fermentation time on total acid content and total sugar utilization

表6 發酵時間對感官評分的影響Tab le 6 Effect of fermentation time on sensory evaluation score

由表6可知，發酵時間過短或過長時，感官評分偏低，發酵液品質不佳，當發酵時間為7 d時，感官評價分值最高，發酵液品質較好。

2.5 葛根茶飲料發酵工藝條件優化

在單因素試驗結果的基礎上，采用正交設計試驗對發酵條件進行優化，正交試驗結果與分析見表7。

表7 發酵工藝優化正交試驗結果與分析Table 7 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology optimization

從表7可知，所選的4個因素對葛根茶飲料發酵的影響依次為發酵時間＞接種量＞搖瓶轉速＞蔗糖添加量。通過極差分析可知，最佳工藝條件為A1B2C3D2，即蔗糖添加量為70 g/L，接種量為8%，搖瓶轉速180 r/min，發酵時間為7 d。在此條件下進行驗證試驗，發酵葛根茶飲料的感官評分為3.5分，產品色澤均勻，酸甜可口，具有葛根發酵茶發酵液特有的風味。

3 結論

以葛根纖維提取物為原料，利用固定化細胞技術實現了葛根茶飲料的固定化發酵，結果表明，通過單因素和正交試驗得出固定化發酵葛根茶飲料的最佳工藝條件為蔗糖添加量70 g/L，接種量8%，搖瓶轉速180 r/m in，發酵時間為7 d。在此條件制備的發酵葛根茶飲料色澤均勻，酸甜可口。

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Preparation process of kudzu root beverage by immobilized kombucha fermentation

WANG Rundong1,SHAO Wei2*
(1.Technology Center of Hubei Wisdom Fruit Forestry Science and Technology Co.,Ltd.,Xingshan 443700,China; 2.College of Biological and Pharmaceutical Sciences,China Three Gorges University,Yichang 443001,China)

Using kudzu root fibers extract as raw materials to conduct fermentation,and the total acid content,total sugar utilization and sensory evaluation on fermentation liquor as evaluation index,the effects of sucrose concentration,inoculum,shaken bottle speed and fermentation time on kudzu root beverage by immobilized cell fermentation was discussed.The processing conditions of kudzu root beverage were optimized by orthogonal experiment as follows:sucrose concentration 70 g/L,inoculum 8%,shaken bottle speed 180 r/min,and fermentation time 7 d.The product had uniform color and distinctive flavor.

kudzu root;kombucha;immobilization;fermentation;beverage

TS261.7

A

0254-5071（2015）03-0158-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.038

2015-02-09

三峽大學生物與制藥學院2013年資助項目（2014HY 005）

王潤東（1987-），男，助理工程師，本科，主要從事食品開發與研究工作。

*通訊作者：邵偉（1966-），男，高級實驗師，碩士，主要從事微生物學教學及研究工作。