Twist1基因對膀胱癌上皮間質轉化的影響*

王小林，曹廣鑫，侯建全

（1南通市腫瘤醫院泌尿外科，江蘇226361；2蘇州大學附屬第一醫院泌尿外科）

Twist1基因對膀胱癌上皮間質轉化的影響*

王小林1**，曹廣鑫1，侯建全2

（1南通市腫瘤醫院泌尿外科，江蘇226361；2蘇州大學附屬第一醫院泌尿外科）

目的：探討Twist1基因對膀胱癌上皮間質轉化（EMT）過程的影響。方法：上調Twist1基因的表達，實時定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測膀胱癌細胞中EMT相關基因表達情況。結果：Twist1基因成功轉染進膀胱癌T24細胞，轉染Twist1的細胞中Twist1 mRNA表達量是轉染空載細胞中的11 920倍。轉染Twist1組表達量為空載組snail1 1.2倍，snail2 1.2倍，E-cadherin 0.8倍，Fibronectin 3.2倍，N-caderin 1.5倍和Vimentin mRNA 1.2倍。方法：Twist1在膀胱癌細胞EMT過程中起到一個正性調控作用，能夠促進膀胱癌細胞EMT過程。

膀胱癌；Twist1基因；上皮間質轉化；實時定量聚合酶鏈反應

2014年全美大約有74 690例新發膀胱癌患者，并有大約15 580例患者死于膀胱癌[1]。上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）與膀胱癌的侵襲、轉移密切相關，同時還與膀胱腫瘤分期、分級相關[2]。Twist1作為EMT中一個重要轉化因子如何發揮作用，目前尚不十分清楚。本研究選取膀胱癌T24細胞作為研究對象，將Twist1轉染進T24細胞，檢測EMT相關基因（上皮細胞標記物如E-cadherin，間葉細胞標記物如fibronectin，vementin，N-cadherin）表達情況，以此了解膀胱癌中Twist1對EMT影響。

1 材料與方法

1.1 材料 pcDNA3.1-Twist1合成與載體構建均由invitrogen公司完成。細胞株：人膀胱癌細胞株T24（中科院上海細胞庫）。主要試劑：培養液：RPMI1640（Hyclone，Cat.:SH30809.01B），10%FBS（Hyclone，Cat.:SV30087.02）。胰酶（GIBCO，Cat.：25200-072）；PBS（Hyclone，SH30256.01B）。質粒抽試劑盒：北京艾德萊，Cat.:PL08。轉染試劑盒：Lonza，Cat: VCA-1001，RNA提取試劑盒：TaKaRa，Cat:9767反轉錄試劑盒：TaKaRa，Cat:RR037A，Power SYBR green PCR master mix（2×）：ABI，Cat:4367659。

1.2 方法

1.2.1 質粒擴增及抽提：含pcDNA3.1、pcDNA3.1-Twist1的菌液分別涂布于含氨芐青霉素（100μg/ mL）的LB平板上，第2天挑取單克隆于50mL含Amp的LB液體培養基中振搖過夜，收集菌體，按質粒抽試劑盒說明書抽提質粒，定量后保存于低溫冰箱。

1.2.2 細胞培養及轉染：T24細胞培養于含10%FBS的RPMI1640培養基中，轉染當天細胞狀態良好。按轉染試劑盒說明書進行操作，轉染完成后分別接種于6孔板培養。

1.2.3 RNA提取反轉錄及qPCR分析：上述細胞培養48小時后，按RNA提取試劑盒提取RNA。定量后以 5×PrimerScript Buffer 2μL，PrimerScript RT Enzyme Mix I 0.5μL，Oligo dT Primer 0.5μL，Random 6 mers 0.5μL，Total RNA 400ng，RNase Free dH2O加至10μL配制RT反應液，放入PCR儀中。設定程序：37℃，15min→85℃，5s→4℃，反轉結束后，定量并保存于4℃。

按 Power SYBR green PCR master mix（2×）15μL，Primer 0.6μL×2，cDNA10ng，ddH2O加至30μL配制qPCR反應液，引物序列見表1，設定反應程序：95℃，10min→95℃，15s；60℃，1min；40cycles→95，15s→60℃，1min→95，15s→60℃，15s。8種基因引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結 果

采用2-△△CT法，以β-actin為內參，定量檢測轉染pcDNA3.1與轉染pcDNA3.1-Twist1的T24細胞中 snail1，snail2，E-cadherin，Fibronectin,N-caderin和Vimentin mRNA的表達水平。結果表明，Twist1轉染成功，轉染Twist1的細胞中Twist1 mRNA表達量是轉染空載細胞中的11 920倍。Twist1組中snail1，snail2，E-cadherin,Fibronectin,N-caderin和Vimentin mRNA的表達量分別是空載組的1.2倍，1.2倍，0.8倍，3.2倍，1.5倍和1.2倍，見表2。

表2 各基因表達情況

3 討 論

在膀胱腫瘤的浸潤轉移過程中，涉及多種分子機制。近年來EMT在腫瘤轉移方面的作用及相關機制的研究，逐漸受到大家的重視，成為有關腫瘤轉移研究方面的熱點之一[3]。在腫瘤浸潤轉移過程中EMT作用過程包括：原發腫瘤上皮細胞轉化成獲得間質表型的細胞，獲得了運動的能力。脫離原發部位侵襲周圍組織進入血液循環后，在遠隔部位通過間質細胞上皮化（mesenchymal-epithelial transition，MET）形成新的轉移灶[4-6]。若符合下述情況可判定細胞發生EMT：細胞由多角形上皮細胞形態轉變成紡錘形的間質細胞形態，失去細胞極性；遷徙和侵襲的能力增加；抗凋亡的能力增加；誘導EMT的因素移除后仍然能夠維持表型的穩定；一些上皮細胞標志物的丟失（E-cadherin），間葉細胞標記物的獲得（fibronectin,vementin,N-cadherin）[7]。EMT與膀胱癌的侵襲、轉移密切相關，同時還與膀胱腫瘤分期、分級相關[2，8]。

EMT主要受一組轉錄因子的控制，包括Zeb-1/ 2，Twist1，Snail和slug。這些因子使組蛋白去乙?；⑴cE-cadherin啟動子中的增強子結合，阻止E-cadherin基因的轉錄及表達[9]。Leptin研究證實在果蠅中胚葉形成過程Twist1通過直接誘導Snail家族中的Snail1表達導致EMT[10]。然而新近研究表明，在人乳腺癌細胞株和活體腫瘤模型中Snail2才是Twist1在抑制E-cadherin活性導致EMT的直接靶點，同時在Snail2缺失的情況下整個EMT進程將被終止[11]。在人膀胱癌細胞中，Twist1是如何發揮其作用，其與Snail家族間關系如何，值得進一步的研究去探索。

本研究發現，上調Twist1基因后，snail1，snail2基因的mRNA表達量呈上升趨勢，表明在人膀胱癌細胞EMT過程中，Twist1與snail1，snail2呈現協調作用方式，但Twist1究竟是和snail1，snail2中的哪個共同發揮作用，還需要進一步的實驗來驗證。同時隨著Twist1基因的上調，E-cadherin表達出現下降，E-cadherin作為EMT過程中的關鍵因子，顯示出的結果與文獻報道相符[12]，表明Twist1在膀胱癌中是通過E-cadherin最后發揮作用。本文還檢測Fibronectin、N-caderin和Vimentin等間質標記物，其mRNA的表達量均出現不同程度的上升，說明在上調Twist1后，人膀胱癌細胞表現出EMT相應表象，進一步證實Twist1能夠在膀胱癌細胞中促進EMT過程發生。

然而，我們發現經過轉染pcDNA3.1-Twist1后的細胞，Twist1表達上升幅度與檢測到相關基因的表達變化程度雖呈現出相關性，但欠缺說服力。在后續工作中，將進一步對于Twist1功能進行深入研究。

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Effect of Twist1 to Epithelial Mesenchymal Transition in Bladder Cancer

WANG Xiaolin1,CAO Guangxin1,HOU Jianquan2
（1Department of Urology,Nantong Tumor Hospital,Jiangsu 226361;2Department of Urology,the First Affiliated of Soochow University）

[Abstart] Objective：To investigate the effect of twist1 to epithelial mesenchymal transition(EMT)in bladder cancer.Methods：The Expression of Twist1 was upgraded,and the expressions of EMT markers in bladder cancer were detected by QPCR.Results：Twist1 was successfully transfected into T24,expressions of Twist1 mRNA were 11920 times as much as in the control.Snail1，snail2、E-cadherin、Fibronectin、N-caderin、Vimentin mRNA were 1.2、1.2、0.8、3.2、1.5、1.2 times as much as in the control respectively.Conclusions：Twist1 acts as a positive regulatory role to EMT in bladder cancer,and may promote EMT in bladder cancer.

bladder cancer;Twist1;epithelial mesenchymal transition;real time polymerase chain reaction

R737.14

A

2015-03-24

1006-2440（2015）03-0231-03

南通市人才工作專項資金（W201208）；南通市社會事業科技創新與示范計劃（HS2013023）。

**[作者簡介]王小林，男，漢族，江蘇南通人，生于1978年11月，醫學碩士，副主任醫師。研究方向：泌尿系統腫瘤基礎與臨床研究。 通信作者：侯建全，E-mail：jianquanhou@163.com