一株石油烴降解菌的固定化及其降解特性研究

一株石油烴降解菌的固定化及其降解特性研究

盧方斌，李榮超，張蕾，王君

(濱州學院生命科學系，山東 濱州 256600)

摘要：從石油污染鹽漬土壤中篩選出一株對液蠟乳化效果明顯、對原油降解率達56.8%的菌株，命名為BZ-L。經生理生化和16S rRNA序列分析，初步鑒定該菌株屬于沙雷氏菌屬。以海藻酸鈉和活性炭為包埋劑，對該菌株進行固定化研究。結果表明，當活性炭含量為0.8%時，固定化微球的破損率最低、滲透性最好；在接種量為35.0 g·L-1、NaCl濃度為6.0%時，固定化微球對原油的降解率可達61.7%；菌株BZ-L的固定化微球對原油的降解率明顯高于游離菌，且比游離菌的耐鹽性能更強，可用于石油污染鹽漬土壤的生物修復。

關鍵詞：石油烴降解菌；固定化微球；降解特性；耐鹽

基金項目：國家級大學生創新創業訓練計劃(201310449146),山東省科學技術發展計劃資助項目(2011YD21005)

收稿日期：2015-06-02

作者簡介：盧方斌(1993-)，男，山東濟寧人，研究方向：微生物修復研究，E-mail:mxzlushang@126.com；通訊作者：王君，副教授，E-mail：ivywangjun@163.com。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2015.11.013

中圖分類號：X 172文獻標識碼：A

在石油污染土壤或水體的修復技術中，微生物修復技術因安全、高效、不產生二次污染等優點成為人們處置石油污染的重要手段[1-3]。土壤中的某些土著微生物可以降解原油，但由于單位菌濃度較低或受環境因素的影響，并不能很好地降解原油。固定化微生物技術是一種高效、可重復、不產生二次污染的治理技術，具有微生物單位密度大、微生物流失少、抗外界脅迫能力強、產物易分離、反應過程易控制的優點[4-6]。

關于石油降解菌的固定化技術已有報道，固定化手段和材料豐富多樣[7-9]。關曉燕等[10]報道了以聚氨酯泡沫為載體制備固定化菌的研究，在120 h內該菌株對柴油的降解率達85%；單海霞等[11]以硅藻土/活性炭作為降解菌群的固定化載體，對最佳固定化條件進行研究，其固定化菌群對柴油的平均降解率達65%。作者從黃河三角洲地區石油污染鹽漬土壤中分離篩選出一株耐鹽降解烴的菌株，采用包埋法對該菌株進行了固定化研究，并測定了固定化微球對原油的降解效果和耐鹽程度。

1實驗

1.1　材料和培養基

土壤樣品采自黃河三角洲濱州石油開采區；原油來自勝利油田孤東采油廠。

無機鹽培養基(g·L-1)：(NH4)2SO44，NaH2PO41.5，K2HPO43.48，MgSO40.7。自然pH值，121 ℃滅菌30 min。

富集培養基：在無機鹽培養基中添加液蠟2%(v/v)。

降解培養基：在無機鹽培養基中添加原油0.5%(w/v)。

牛肉膏蛋白胨培養基(g·L-1)：牛肉膏3，蛋白胨5，NaCl 5。pH值7.2，121 ℃滅菌30 min。

1.2　石油降解菌的富集和分離純化

將2 g土壤樣品加入200 mL富集培養基中，160 r·min-1、37 ℃下振蕩培養5 d后，以10%接種量轉接至新的富集培養基中培養，連續轉接培養數次。將富集培養液進行梯度稀釋，涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養基上培養，挑取單菌落分別接種至富集培養基中，選取對液蠟乳化良好的菌株進行下一步研究。

1.3　菌種的鑒定

1.3.1生理生化特征鑒定

菌株的生理生化特征鑒定參照《常見細菌系統鑒定手冊》[12]。

1.3.2菌株的16S rRNA分析

用試劑盒提取已篩選菌的DNA，利用細菌16S rRNA基因通用引物27F和1492R擴增基因序列[13]。PCR反應體系的反應條件為：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環;72 ℃延伸10 min。擴增產物經電泳檢測后送北京三博遠志公司測序，測序結果在NCBI網站進行BLAST比對。利用Clustal 2.0和Mega 4.1軟件構建系統發育樹。

1.4　固定化菌株的構建

1.4.1細胞懸液的制備

將得到的石油降解菌株接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，37 ℃恒溫搖床振蕩培養18 h，培養液于8 000 r·min-1離心5 min，沉淀加入無菌水重懸，使菌懸液中的細胞濃度為1.2×108個·mL-1，保存備用。

1.4.2固定化微球的制備

采用注射器滴落法制備固定化微球[14]。稱取0.7 g海藻酸鈉放入50 mL的燒杯中，加入10 mL水后用酒精燈加熱，邊加熱邊攪拌至海藻酸鈉完全溶化，用蒸餾水定容至10 mL。將溶化好的海藻酸鈉溶液冷卻到室溫，加入已制備好的細胞懸液和終含量分別為0.0%、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%的活性炭粉末，充分攪拌使其混合均勻，再轉移至注射器中，以恒定的速度緩慢地將注射器中的溶液滴加到濃度為0.05 mol·L-1的CaCl2溶液中(CaCl2溶液需提前放入冰槽內)。反應完成后將固定化微球取出，用生理鹽水洗滌，備用。

1.5　固定化微球物理性能的測定

1.5.1固定化微球的破損率

隨機取活性炭含量分別為0.0%、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%的固定化微球各50顆，放入裝有100 mL蒸餾水的250 mL錐形瓶中，置于37 ℃、160 r·min-1恒溫搖床中振蕩72 h，記錄微球的破碎顆數并計算破損率。

1.5.2固定化微球的滲透性

隨機取活性炭含量分別為0.0%、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%的固定化微球浸入墨水中，每隔 4 min 取球剖開，直到微球被墨水完全滲透為止[15]，記錄所需的時間。

1.6　固定化微球對原油的降解

1.6.1接種量對原油降解率的影響

分別向降解培養基中接種5.0 g·L-1、15.0 g·L-1、25.0 g·L-1、30.0 g·L-1、35.0 g·L-1、40.0 g·L-1的固定化微球，在37 ℃下振蕩培養10 d，測定原油降解率。

1.6.2固定化微球對NaCl的耐受性

配制NaCl濃度分別為0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、10.0%、15.0%的降解培養基，以35.0 g·L-1的接種量加入固定化微球，37 ℃下振蕩培養10 d，測定原油降解率，以游離菌株作為對照。

1.7　原油降解率的測定

由于固定化載體材料表面會吸附原油，簡單的萃取并不能將原油全部萃出。首先向原油培養基中加入50 mL正己烷，用膠塞緊塞瓶口，充分振蕩，萃取培養液中殘留原油，然后把固定化微球取出，用正己烷作溶劑進行索氏抽提，最后合并兩部分含油溶液，用紫外分光光度法測定原油降解率[16]。

2結果與討論

2.1　菌種的篩選及分離

經富集培養，從石油污染鹽漬土壤中篩選得到一株石油烴降解菌，命名為BZ-L。該菌株對液蠟具有明顯的乳化效果(圖1)，且在NaCl濃度為4.0%時，對原油的降解率達到56.8%。

A.實驗組　B.對照組 圖1　菌株BZ-L對液蠟的乳化 Fig.1　Emulsification of liquid paraffin by strain BZ-L

2.2　菌株BZ-L的分類鑒定

將菌株BZ-L接種在牛肉膏蛋白胨固體平板上，37 ℃下培養48 h，菌落呈橘紅色，圓形，邊緣整齊，表面光滑不透明，易挑??；革蘭氏染色為陰性，菌體呈短桿狀，兩端鈍圓。該菌株可利用葡萄糖、蔗糖、D-果糖發酵產酸，不能利用D-阿拉伯糖、D-木糖發酵產酸；不能利用尿素、精氨酸產生硫化氫；甲基紅、丙二酸、明膠、酯酶、檸檬酸鹽、賴氨酸脫氫酶、鳥氨酸脫氫酶、V-P反應均為陽性。

將擴增得到的 16S rRNA 基因序列在NCBI數據庫中進行BLAST比對，發現菌株 BZ-L跟粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)的同源性最近，相似度達99%。采用Clustal 2.0和Mega 4.1軟件構建系統發育樹，見圖2。

圖2　菌株BZ-L與相關菌株的系統發育樹 Fig.2　Phylogenetic trees of BZ-L and related strains

根據生理生化特征和16S rRNA序列分析，初步鑒定菌株BZ-L屬于沙雷氏菌屬。

2.3　固定化微球物理性能的測定

2.3.1固定化微球的破損率(圖3)

圖3　活性炭含量對固定化微球破損率的影響 Fig.3　The effect of content of activated carbon on damage rate of immobilized microspheres

由圖3可知，當活性炭含量在0.0%~0.8%之間時，固定化微球的破損率隨著活性炭含量的增加而下降，這是由于活性炭可以提升固定化微球的韌性；而當活性炭含量大于0.8%后，微球的破損率上升，可能是由于活性炭的過多加入導致固定化微球空隙過大、松散。

2.3.2固定化微球的滲透性(圖4)

圖4　活性炭含量對固定化微球滲透性的影響 Fig.4　The effect of content of activated carbon on permeability of immobilized microspheres

由圖4可知，當活性炭含量為0.8%時，固定化微球的滲透時間為16 min；再增加活性炭含量，固定化微球的滲透時間幾乎保持不變。因此，選取固定化微球中活性炭含量為0.8%。

2.4　固定化微球對原油的降解特性

2.4.1接種量對原油降解率的影響(圖5)

圖5　接種量對原油降解率的影響 Fig.5　The effect of inoculation amount on degradation rate of crude oil

由圖5可知，隨著接種量的增大，固定化微球對原油的降解率不斷升高；當接種量達到35.0 g·L-1時，

固定化微球對原油的降解率達到58.3%；再增大接種量，固定化微球對原油的降解率反而下降。

2.4.2固定化微球對NaCl的耐受性(圖6)

圖6　固定化微球和游離菌在不同NaCl濃度下對原油的降解率 Fig.6　Degradation rates of crude oil by immobilized microspheres and free strains in presence of different concentrations of NaCl

由圖6可知，固定化微球在NaCl濃度為6.0%時，對原油的降解率最高，達到61.7%；而游離菌在NaCl濃度為4.0%時，對原油的降解率最高，為56.8%；當NaCl濃度高達10.0%以上時，游離菌和固定化微球都對原油有一定的降解，并且在相同NaCl濃度下，固定化微球對原油的降解效果明顯好于游離菌。

3結論

從黃河三角洲石油污染的鹽漬土壤中分離得到一株石油烴降解菌BZ-L，初步鑒定為沙雷氏菌屬。用海藻酸鈉和活性炭對該菌進行固定化，在活性炭含量為0.8%的條件下，固定化微球的破損率較低，并具有良好的滲透性。以35.0 g·L-1接種量接種至降解培養基中，發現該固定化微球對原油的降解率比游離菌有顯著提高，達到61.7%，對NaCl的耐受性提高到6.0%。菌株BZ-L及其固定化微球在石油污染土壤的生物修復中有良好的應用前景[17]。

參考文獻：

[1]陸秀君,郭書海,孫清,等.石油污染土壤的修復技術研究現狀及展望[J].沈陽農業大學學報,2003,34(1):63-67.

[2]徐金蘭,黃廷林,唐智新,等.高效石油降解菌的篩選及石油污染土壤生物修復特性的研究[J].環境科學學報，2007，27(4)：622-628.

[3]HEAD I M,JONES D M,ROLING W F.Marine microorganisms make a meal of oil[J].Nature Reviews Microbiology,2006,4(3):173-182.

[4]胡文穩,王震宇,劉居東,等.黃河三角洲原油污染土壤的微生物固定化修復技術[J].環境科學與技術,2011,34(3):116-120.

[5]ZEROUAL Y，MOUTAOUAKKIL A，BLAGHEN M.Volatilization of mercury by immobilized bacteria(Klebsiellapneumoniae) in different support by using fluidized bed bioreactor[J].Current Microbiology，2001，43(5):322-327.

[6]ROBATJAZI S M，SHOJAOSADATI S A，KHALILZADEH R，et al.Continuous biodegradation of parathion by immobilizedSphingomonassp.in magnetically fixed-bed bioreactors and evaluation of the enzyme stability of immobilized bacteria[J].Biotechnology Letters，2013,35(1):67-73.

[7]王玉建,李紅玉.固定化微生物在廢水處理中的研究及進展[J].生物技術，2006，16(1)：94-96.

[8]FENG Y，RACKE K D，BOLLAG J M.Use of immobilized bacteria to treat industrial wastewater containing a chlorinated pyridinol[J].Applied Microbiology and Biotechnology，1997，47(1):73-77.

[9]JIANG B，ZHOU Z C，DONG Y，et al.Bioremediation of petrochemical wastewater containing BTEX compounds by a new immobilized bacteriumComamonassp.JB in magnetic gellan gum[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2015,176(2):572-581.

[10]關曉燕,董穎,王擺,等.一株海洋石油降解菌的篩選鑒定及其固定化研究[J].遼寧師范大學學報,2013,36(3)：400-405.

[11]單海霞,劉曉宇,張穎,等.硅藻土/活性炭對降解菌群的固定化研究[J].油氣田環境保護,2013，24(4)：19-21.

[12]東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京:科學出版社,2001.

[13]LANE D J.16S/23S rRNA sequencing[M]//Stackebrandt E，Goodfellow M，eds.Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics.Chichester，UK：Wiley J，1991：115-175.

[14]張秀霞,秦麗姣,吳偉林,等.固定化原油降解菌的制備及其性能研究[J].環境工程學報，2010,4(3):659-664.

[15]包木太,田艷敏,陳慶國.海藻酸鈉包埋固定化微生物處理含油廢水研究[J].環境科學與技術，2012,35(2)：167-172.

[16]張秀霞,耿春香,房苗苗,等.固定化微生物應用于生物修復石油污染土壤[J].石油學報(石油加工),2008,24(4)：409-414.

[17]王傳遠,楊翠云,張志高,等.黃河三角洲生態區土壤石油污染及其與理化性質的關系[J].水土保持學報,2010,24(2)：214-217.

Immobilization and Degradation Characteristics of A Petroleum-Degrading Strain

LU Fang-bin，LI Rong-chao，ZHANG Lei,WANG Jun

(DepartmentofLifeSciences，BinzhouUniversity，Binzhou256600，China)

Abstract：A petroleum-degrading strain named as BZ-L was isolated from the petroleum contaminated saline soil，which could emulsify liquid paraffin well and degradation rate of petroleum was 56.8%.The strain was belonged to Serratia marcescens，according to physical and biochemical characteristics and 16S rRNA sequence analysis.Sodium alginate and activated carbon were employed as embedding agents to study the immobilization of the strain.Results showed that damage rate of the immobilized microspheres were the lowest and the permeability was the best when content of activated carbon was 0.8%.The degradation rate of petroleum by the immobilized microspheres was 61.7%，with the inoculation amount of 35.0 g·L-1 and the NaCl concentration of 6.0%.The degradation rate of petroleum by the immobilized microspheres was higher than that of the free strain，and they were more halotolerant.Strain BZ-L and the immobilized microspheres could be used in the bioremediation of the petroleum contaminated saline soil.

Keywords：petroleum-degrading strain;immobilized microspheres;degradation characteristics;halotolerant