耐鹽促生菌的篩選、鑒定及其對黃瓜的促生作用

錢蘭華 錢瑋 沈雪林 胡翠英 劉乾 蔣晨威 朱昫飏 王桃云

摘要：為獲得耐鹽促生菌株并明確其促生特性，通過耐鹽試驗和ACC脫氨酶活性對沿海灘涂鹽堿地土壤中的微生物進行分離篩選，得到5株耐鹽菌株，其中B7的耐鹽活性最強。接著采用平皿法和盆栽法研究了鹽脅迫下黃瓜種子發芽及盆栽試驗中B7對黃瓜的耐鹽促生作用。同時對B7的多種促生能力進行測定，最后通過菌株形態、生理生化特征測定及其16S rDNA序列鑒定出B7菌株為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。研究結果表明，該菌株能明顯提高黃瓜耐鹽促生能力，同時具有產吲哚乙酸（IAA）、產氨、固氮及解磷等多種促生能力，因而具有廣泛的應用前景。

關鍵詞：耐鹽;分離篩選;鑒定;巨大芽孢桿菌;黃瓜;促生作用

中圖分類號： S154. 39文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）18-0160-04

收稿日期：2018-05-31

基金項目：江蘇省蘇州市科技計劃項目-應用基礎研究計劃（編號：SYN201525）。

作者簡介：錢蘭華（1976—），女，江蘇興化人，副教授，主要從事植物病蟲害綜合防治研究。E-mail：lanhuaqian@126.com。

通信作者：王桃云，博士，副教授，主要從事植物、微生物資源研究。E-mail：wangtaoyun@usts.edu.cn。

土壤鹽漬化是一個全球性的農業問題，是當前威脅全球農業生產和農作物產量的主要非生物脅迫因子，目前全球有50%的灌溉土地受到不同程度的鹽害[1]。中國鹽漬土壤的分布范圍廣、類型多，總面積約1億hm2，而且鹽堿地面積正逐年增加[2]。如何改良和利用大面積鹽漬化土地，以及保護并提高重要的經濟作物抵抗鹽脅迫的能力是當前國際社會亟待解決的重要農業科技問題。目前，主要生物改良方法是培育并種植耐鹽堿作物，如種植檉柳、水稻、向日葵以及耐鹽植物田菁、紫穗槐等，此外還有耐鹽轉基因植物的研究，但該類方法往往周期長、花費大，同時，植物轉基因方法還未被社會廣泛接受和認可[3]。

根際微生物是指在植物根系土壤范圍內生長繁殖細菌、放線菌、真菌等微生物。大多數根際微生物對植物無害且對植物生長有促進作用。這些根際微生物具有固氮、溶磷、產生植物生長激素、鐵載體以及誘導植物抗性的功能。利用根際微生物提高鹽堿地作物耐鹽促生能力的方法具有投資少、見效快、效益高等特點。因此有關根際微生物耐鹽促生的功能活性研究已經受到相關研究者的廣泛關注[4]。

本研究擬對沿海灘涂植物根系周圍土壤中耐鹽微生物進行篩選，并對篩選出的優勢耐鹽菌株耐鹽特性、多種促生能力及其對鹽脅迫下黃瓜種子發芽及盆栽試驗中的耐鹽促生作用進行研究。最后通過菌株形態、生理生化特征測定及其16S rDNA序列初步鑒定出耐鹽優勢菌株的種屬，以期為提高農作物抗鹽能力提供新策略。

1?材料與方法

1.1?樣品采集

土樣采自江蘇省南通市啟東呂四鎮的海邊灘涂，土壤采樣深度為5～20 cm，采回的土壤經風干、粉碎后過100目篩待用。

1.2?主要儀器

超凈工作臺（SW-CJ-1FD），上海新苗醫療器械公司;高速冷凍離心機（Fresco 17），美國Thermo公司;高壓蒸汽滅菌鍋（LDZX-50FB），上海博迅實業有限公司;數顯pH計（PHS-3TC），上海天達儀器有限公司;紫外可見分光光度儀（UV-2450），日本島津公司;恒溫搖床（TS-2102），上海天呈實驗儀器制造有限公司;光學顯微鏡（CX21），日本奧林巴斯公司。

1.3?主要試劑與培養基

2-羥基丁二酸，2-甲基-3-羥基-4，5-二羥甲基吡啶鹽酸鹽，哌嗪-1，4-二乙磺酸，吲哚-3-乙酸，三氧化鉬，乙二胺四乙酸鐵鈉等購于上海阿拉丁生化科技有限公司;胰蛋白胨，酵母粉，瓊脂粉，氯化鈉，α-氨基吲哚基丙酸，維生素H，考馬斯亮藍，奈斯勒試劑和鉬酸鈉等購于上海國藥集團化學試劑有限公司。

LB培養基，無機磷和有機磷培養基，CAS檢測平板，AF培養基，DF培養基和ADF培養基，無色氨酸King培養基，WA培養基，NA培養基等[5-7]。

1.4?耐鹽菌株的分離篩選

1.4.1?土壤菌株分離純化?取處理好的土樣1 g懸浮于裝有100 mL無菌水的250 mL三角錐形瓶中，在30 ℃、180 r/min 搖床中振蕩30 min，靜置10 min，得到土壤懸浮液。然后將此懸浮液稀釋為原始濃度的10-1～10-5倍，涂布于LB培養基平板上，于30 ℃在恒溫培養箱中培養24 h后，挑取各種不同類型的單菌落，經過多次平板純化后，接種于LB斜面并在4 ℃冰箱中保存備用。

1.4.2?菌株耐鹽能力測定[8]?利用含一定NaCl濃度的NA培養基篩選耐鹽菌株。用移液器分別取土壤稀釋液0.1 mL涂布于鹽濃度為6%的培養基平板上，30 ℃培養3 d，以相同條件下各平板中菌落數量多少來篩選耐鹽優勢菌株。

1.4.3?耐鹽菌株ACC脫氨酶活性測定

通過制作α-丁酮酸標準曲線來測定α-丁酮酸含量：按照趙龍飛等所述方法[9]，測定菌株粗酶液在540 nm波長下的吸光度，并以α-丁酮酸標準品的濃度（mmol/L）為橫坐標，以吸光度（D540 nm）為縱坐標，繪制α-丁酮酸標準曲線，計算粗酶液中的α-丁酮酸含量。

ACC脫氨酶比活力測定：參照Bradford的方法[10]比色測定細胞提取液中總蛋白質含量，以牛血清白蛋白作為標準物，繪制牛血清白蛋白標準曲線。參考Saleh等的方法[11]，以反應體系中每毫克菌體蛋白酶每小時催化ACC脫氨生成α-丁酮酸的微摩爾量表示ACC脫氨酶活性，其單位為μmol/（mg·h），設置空白對照。測定結果為3次重復值。

1.5?優勢耐鹽菌株B7的各種促生能力測試

1.5.1?B7固氮能力的測定[12]

活化細菌，挑取單菌落于LB培養液中培養18 h，分別吸取10 μL菌液到固氮培養基（NFb）平板上，菌株能在NFb中生長，且能使培養基變藍者視為有固氮活性，記錄為“+”，不變色記錄為“-”。

1.5.2?B7菌株解磷能力測定

參照Ribeiro等所述方法[13-14]，活化B7菌株，挑取單菌落于2 mL LB培養液中培養18 h，分別吸取10 μL菌液到有機磷培養基（OPA）和無機磷培養基（NPA）平板上，28～30 ℃培養96 h。觀察方法：NPA平板上有無透明圈，有透明圈者記錄為“+”，無透明圈者記錄為“-”;OPA平板上有渾濁斑記為“+”，無渾濁斑則記錄為“-”;

1.5.3?B7菌株產嗜鐵素活性的檢測

通過CAS檢測平板法進行細菌產嗜鐵素活性檢測[15]。根據檢測平板中是否產生橘黃色暈圈來判斷菌株是否能產生嗜鐵素。觀察方法：CAS平板上有橘黃色暈圈者記錄為“+”，無橘黃色暈圈者記錄為“-”。

1.5.4?B7菌株產IAA能力測定

參照Wichner等的方法[16-17]，將分離純化后的菌株接種于具有L-色氨酸的LB液體培養基中，搖床培養24 h。取50 μL菌懸液滴于白色陶瓷板上，加入等量Salkowski顯色液進行顯色反應，同時以加入等量IAA標準液作為陽性對照，在室溫、避光條件下放置顯色0.5 h，顏色變紅者表示能夠產生IAA。

1.5.5?B7菌株產氨能力測定

產氨能力的測定參照康貽軍等的方法[5]。將菌株轉接到含10 mL蛋白胨水（10 g/L）試管中，28 ℃培養48 h，每管加入0.5 mL Nesslers試劑，顏色由褐色轉為黃色的表明有氨產生。試管中溶液由褐色轉為黃色者記錄為“+”，試管中溶液不變色者記錄為“-”。

1.5.6?菌株賦值評估

根據以上促生能力測試結果，對耐鹽優勢菌B7的促生潛力進行賦值評估，具有某種促生能力時賦1分，沒有該促生能力時賦0分。

1.5.7?B7菌株酸產堿能力測定

取B7菌懸液200 μL加到NFM培養基（50 mL）中，在搖床上以180 r/min、30 ℃條件下培養3 d。觀察顏色，若培養液變成黃色則說明此菌株是產酸菌株;若變成藍色則說明此菌株是產堿菌株。

1.6?耐鹽生長曲線的測定

配制不同氯化鈉濃度（2%、4%、6%、8%、10%）的LB液體培養基，將B7接種至不同鹽濃度的培養基中，在搖床上以180 r/min、30 ℃條件下培養24 h后取出，在600 nm波長下測定其吸光度，以鹽濃度為橫坐標，D值為縱坐標，制作耐鹽生長曲線。

1.7?菌株理化性質檢測

參照《常見細菌系統鑒定手冊》[18]和《伯杰細菌鑒定手冊》（第8版）[19]進行耐鹽優勢菌株B7的形態和生理生化鑒定。

1.8?菌株B7分子學鑒定

將菌株用LB液體培養液培養至對數生長期，離心收集菌體，采用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒，提取總基因組DNA，采用通用引物27F/1492R（正向引物5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，反向引物：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行16S rDNA基因擴增。產物測序后，將測序的結果輸入NCBI網站上的BLAST程序進行比對，構建系統發育樹以確定菌株的分類。

1.9?菌株B7對黃瓜發芽的促生試驗

取黃瓜種子適量放入燒杯中進行消毒滅菌，然后用無菌水清洗3次;把上述已清洗好的黃瓜種子放入耐鹽菌株B7菌液中浸泡6 h，備用。準備適量的培養皿，將脫脂棉平鋪在培養皿底層，蓋好后滅菌待用;配置不同鹽濃度的氯化鈉溶液，滅菌后倒入培養皿中并沒過脫脂棉，做好標記;將已經浸泡過菌液的黃瓜種子放入不同鹽濃度的培養皿中，每個培養皿中放40個種子（以加蒸餾水的培養皿作為空白對照），放入光照培養箱中25 ℃培養7 d（前3 d暗培養，后4 d12 h光照培養，12 h暗培養）;試驗結束后記錄黃瓜種子發芽率、鮮質量和干質量（每組3個重復）。

1.10?菌株B7對盆栽黃瓜的促生試驗

取黃瓜種子適量放入燒杯中進行消毒滅菌，然后用無菌水清洗3次;把上述已清洗好的黃瓜種子放入耐鹽菌株B7菌液中浸泡6 h，備用。采用營養土與蛭石（體積比4 ∶1）混合得到盆栽基質，然后在121 ℃滅菌1 h，冷卻后裝至穴盆中（長10 cm×寬10 cm×高10 cm），每盆裝入200 g。分別設置空白對照組（無鹽脅迫）、鹽脅迫組和鹽脅迫加菌組，每組做5個重復。每盆種入處理好的黃瓜種子3粒（鹽加菌組的種子先用菌株B7菌液浸泡6 h，空白組和鹽脅迫組用滅菌水浸泡6 h），接著用不同溶液澆灌（空白組用無菌水澆灌，鹽加菌組用菌株B7菌液混合200 mmol/L NaCl溶液澆灌，鹽脅迫組用200 mmol/L NaCl溶液澆灌），每周澆灌處理1次，其余時間都澆灌無菌水，出苗后，算出發芽率和出苗率，然后每盆保留1株幼苗，1個月后測定總根長、總投影面積、總根表面積、平均根系直徑和根尖數等生長指標及可溶性糖、賴氨酸含量等生理指標。

1.11?數據分析

采用Excel 2010作圖，SPASS 19.0進行數據分析。

2?結果與分析

2.1?耐鹽細菌的分離篩選

采用平板稀釋法共分離出27株菌株，經過耐鹽試驗的定性篩選，共有5株耐鹽菌株。耐鹽菌株命名分別為B1、B3、B5、B6和B7，其余22個菌株都沒有在6%鹽濃度的平板上長出來。5個菌株耐鹽試驗結果（表1）顯示，B7菌株的耐鹽活性最強。同時，菌株ACC脫氨酶活性試驗結果（表2）顯示，菌株B7的ACC脫氨酶活性最強，達到0.852 U/（mg·h）。由耐鹽試驗和各菌株ACC脫氨酶活性試驗結果可知，B7菌株的耐鹽能力和ACC脫氨酶活性都優于其他幾個耐鹽菌株，因此選擇B7菌株進行進一步研究。

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