1株豬源乙型腦炎病毒株的免疫原性研究

唐波　張道華　張雪花等

摘要：將從江蘇地區篩選出的1株增殖性能穩定豬源JEV JS01毒株作為疫苗，用毒株制備滅活疫苗進行免疫原性研究。試驗采用經過細胞傳代獲得JEV JS01病毒液（1×107.5 TCID50/mL），以甲醛滅活后加入油佐劑，制備豬源乙型腦炎滅活疫苗。腹腔免疫9～12 g小鼠，攻毒保護結果顯示對照組小鼠全部死亡，免疫組90%以上健活。分別肌肉注射免疫仔豬及后備母豬，不同時間采集血清測定JEV ELISA抗體。檢測結果顯示，免疫后試驗豬血清抗體效價較免疫前均有顯著提高，后備母豬免疫8個月后抗體仍全部為陽性，抗體水平與免疫劑量呈正相關性。試驗表明該豬源乙腦病毒JS01毒株具有良好的免疫原性，可以用作疫苗用毒株。

關鍵詞：豬源乙型腦炎病毒；免疫原性；滅活疫苗

中圖分類號： S855.99文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0306-02

收稿日期：2015-05-28

基金項目：江蘇省農業科技自主創新資金[編號：CX（11）2047]；江蘇省科技支撐計劃（編號：BE2012370）。

作者簡介：唐波（1982—），男，江蘇海安人，碩士，助理研究員，主要從事動物分子病原學及免疫學研究。Tel：（025）84392058；E-mail：2005107058@163.com。

通信作者：張道華，研究員，主要從事動物分子病原學及免疫學研究。Tel：（025）84392058；E-mail：zhangdh2005@163.com。流行性乙型腦炎病是由乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus）引起的一種人獸共患傳染病[1]。人感染后主要表現腦炎神經癥狀，但并不傳播。豬乙型腦炎病主要表現為公豬睪丸炎、母豬繁殖障礙等，多數豬呈隱性感染并表現病毒血癥的形式[2]?；家倚湍X炎病以及隱性感染的豬在病毒血癥階段都可成為最主要的傳染源，在自然界總構成豬→蚊→人的鏈式傳播[3]。該病的流行給養豬業帶來巨大經濟損失，每年給我國養豬業造成的經濟損失達數十億元[4]。鑒于感染乙型腦炎的豬是人類乙型腦炎的重要傳染源，因此豬乙型腦炎的防治在公共衛生方面也具有極其重要的意義[5]。

目前防治豬乙型腦炎病最經濟有效的方法仍是接種疫苗[6]。我國預防豬群流行性乙型腦炎與人乙腦防控應用的是同一弱毒株SA14-14-2株弱毒活疫苗，雖然已證實該毒株在人類應用的安全性和有效性[7～8]，但是在豬群中廣泛接種人用乙腦減毒活疫苗的合理性、潛在的危害性還是越來越引起人們關注。本研究用經過傳代篩選獲得1株增殖性能穩定的豬源JEV毒株作為疫苗候選株進行相關免疫原性研究，為研制高效、安全的BHK-21傳代細胞系豬源乙型腦炎滅活疫苗打下基礎。

1材料與方法

1.1細胞及毒株

BHK-21 細胞系購買自ATCC，JEV JS01毒株由江蘇省農業科學院分離、鑒定和保存。

1.2主要試劑

DMEM 培養基和胎牛血清 （FBS） 購自 GIBCO公司；豬乙型腦炎病毒ELISA抗體檢測試劑盒購自武漢科前動物生物制品有限責任公司；乙型腦炎弱毒活疫苗購自上海海利生物藥品有限公司。

1.3病毒培養及含量測定

將細胞生長覆蓋率達80%的BHK21細胞培養物，去生長液。按感染復數為0.2%～0.5%接種JEV-JS株F4代病毒液，加入含2%FBS的DMEM液，35 ℃培養。當顯微鏡下觀察到細胞達75% CPE（細胞病變）時，凍融收獲病毒液。96孔板測定病毒滴度，將病毒液用DMEM液作10倍系列稀釋，取10-1～10-7稀釋度分別接種，每孔接種量為0.1 mL，同時設立DMEM液陰性對照孔。35 ℃下培養，觀察CPE，計算TCID50。

1.4滅活疫苗的制備

在病毒液中加入終濃度達到0.1%甲醛，于37 ℃作用 48 h，其間每隔6 h攪拌或振搖1次，獲得滅活后的病毒液。將滅活后的病毒液進行滅活檢驗，用DMEM液1 ∶10稀釋后，接種細胞同時設立陰性對照孔，37 ℃下培養，觀察細胞病變（CPE）。盲傳3代，如果無細胞病變（CPE）則表明滅活完全。由滅菌的吐溫-80與滅活病毒液按體積比例4 ∶96混合均勻組成水相。按照體積比為3 ∶1將油相和水相進行混合并乳化，制備滅活疫苗。

1.5JEV JS01免疫原性研究

1.5.1小鼠免疫原性試驗9～11 g清潔級健康小鼠90只，隨機分成9組，每組10只。1組為對照組，注射無菌PBS緩沖液；4組為弱毒活疫苗組，分別取弱毒活疫苗10-1～10-4 4個稀釋度腹腔注射0.1頭份/只；另外4組腹腔接種豬乙型腦炎滅活疫苗，接種劑量分別為0.1、0.05、0.025、 0.012 5 mL/只，間隔7 d后用同等劑量加強免疫1次；加強免疫7 d后用病毒含量為2×103 LD50/0.2 mL的JEV-JS01株病毒液進行強毒腹腔接種攻擊。自攻毒之日起逐日觀察至14 d判定結果（3 d內死亡不計）。

1.5.2仔豬免疫原性評價用豬乙型腦炎滅活疫苗肌肉注射40日齡健康仔豬，分0.5、1.0、2.0 mL/頭共3個劑量組，每組4頭；另設對照組3頭，注射生理鹽水2 mL/頭。免疫后1、2、3、4周分別采血分離血清，用豬乙型腦炎病毒ELISA抗體檢測試劑盒檢測血清ELISA抗體的，D630 nm﹥0.32為陽性。

1.5.3后備母豬免疫期及抗體消長規律研究將健康易感后備母豬20頭進行分組試驗，分為4組，每組5頭。其中1組為對照組，其他3組為免疫組。免疫組在配種前45 d肌注豬乙型腦炎滅活疫苗，接種劑量分別0.5、1.0、2.0 mL/頭，間隔2周后分別用同等劑量疫苗加強免疫1次。對照組，注射生理鹽水2 mL/頭。免疫后2周、4周、2月、4月、6月、8月分別采血分離血清，用豬乙型腦炎病毒ELISA抗體檢測試劑盒檢測ELISA抗體，D630 nm﹥0.32為陽性。

2結果

2.1病毒培養及滴度測定

病毒接種細胞72 h后（觀察CPE達75%時）凍融收獲病毒液，測定病毒滴度。用Karber氏法計算出乙腦病毒JS01株F5代病毒含量達到1×107.5TCID50/mL。

2.2小鼠免疫原性試驗

在第2次免疫后第7天攻毒，逐日觀察至第14天。攻毒后空白對照組的小鼠從第6天開始表現出神經癥狀逐漸全部死亡，活疫苗各劑量免疫組對小鼠的保護率均為100%（10/10），滅活疫苗各劑量組總健活率為92.5%。結果表明，該病毒制備的白油佐劑滅活疫苗也可以刺激機體產生較好的免疫應答，對小鼠的保護率高（表1）。

表1JEV JS01株攻擊免疫小鼠的保護率

組別免疫劑量保護率（%）空白對照0弱毒活疫苗10-110010-210010-310010-4100滅活疫苗0.1 mL1000.05 mL1000.025 mL900.012 5 mL80

2.3仔豬JEV ELISA抗體檢測結果

疫苗免疫仔豬后JEV ELISA抗體檢測結果表明，所有劑量組仔豬免疫后免疫1周抗體全部轉陽，隨后抗體效價逐步增高，免疫后2～4周抗體效價均維持較高水平（圖1）。表明該JEV JS01株對仔豬具有良好的免疫原性，能夠較好地刺激機體產生免疫作用，免疫后仔豬抗體產生快、效價高。

2.4后備母豬免疫期及抗體消長規律

免疫后2周、4周、2月、4月、6月、8月分別采血分離血清測定抗體，結果見圖2。不同劑量組疫苗免疫后備母豬2周后ELISA抗體全部轉陽，第14天二次免疫后抗體水平均有大幅度的提升?？贵w效價在免疫后2周至6個月均能維持在較高的水平，免疫后8個月所有劑量組母豬抗體仍全部為陽性。該結果表明JEV JS01株具有較好的免疫原性，免疫后抗

體水平高且持續時間長。

3討論

一直以來我國對JEV 的研究大多集中在人源和蚊源株，對豬源性JEV的研究重視不夠，對豬源乙腦毒株相關免疫原性的研究很少。近年來，國內外學者陸續從豬體中分離出多株乙腦病毒，關于豬源JEV的報道越來越多[9～10]。然而有研究表明，一些豬源性分離毒株在分子特征上更接近現行弱毒株SA14-14-2，進化樹分析表明這些分離株與疫苗株的親緣關系更近，可能是疫苗株在自然界發生毒力返強或者是與其他毒株在豬體內發生重組所致[11～12]。因此，加大對豬源乙型腦炎病毒滅活疫苗的開發研究，對解決乙腦減毒活疫苗在豬群中使用的潛在危害具有重大意義。

近年來，國內外學者陸續開展了豬源乙型腦炎病毒滅活疫苗的研究工作。喬進平等應用豬源乙腦病毒株GZ0409-31制備滅活疫苗免疫動物，結果表明該病毒制備的滅活疫苗可以刺激機體產生免疫應答和免疫保護性抗體[13]。Yang等應用豬源乙腦病毒KV1899制備滅活疫苗免疫母豬也可以刺激機體產生免疫保護性抗體[14]。良好的滅活疫苗需要有良好的抗原作為基礎才能使機體獲得最佳的保護性免疫。國內目前尚無商品化的豬源乙腦滅活疫苗。本研究選用免疫原性良好的豬源乙腦病毒研究疫苗的免疫效力，為研制高效、安全的豬乙腦滅活疫苗奠定基礎。

本研究選用經BHK-21細胞培養增殖性能穩定JS01株豬源乙腦病毒作為疫苗用毒株，制備的滅活疫苗可以刺激機體產生很好的免疫應答，對小鼠具有較高保護率。所有劑量組疫苗免疫仔豬后1周抗體全部轉陽，抗體產生快、效價高。后備母豬免疫后抗體效價在免疫后6個月均能維持在較高的水平，免疫后8個月所有劑量組抗體仍全部為陽性，抗體水平與免疫劑量呈正相關性。免疫試驗結果證明該JEV JS01株具有較好的免疫原性， 該病毒制備的滅活疫苗能夠刺激機體

產生免疫保護性抗體和長時間免疫應答，可以用作豬源乙腦滅活疫苗用毒株。

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