響應面法優化放線菌BOS—018的液體發酵工藝

王勇 曹艷杰 張文革

摘要：為了提高放線菌BOS-018代謝產物中有效代謝物質濃度，得到更多的活性成分，并提高其抑菌活性，采用響應面法來優化放線菌BOS-018的液體發酵條件。先通過單因素試驗確定最佳單因素，再運用Plackett-Burman試驗對影響發酵的幾個因素進行評價并篩選出3個最主要因素，即溫度、接種量和裝液量。經最陡爬坡試驗，最后運用Box-Behnken設計得到這3個因素的最佳值為：溫度27.74 ℃，接種量13.26 mL，裝液量102.07 mL。優化后，抑菌圈直徑達到22.12 mm，相對于優化前提高36.7%。

關鍵詞：放線菌；發酵優化；響應面法；Plackett-Buman試驗；最快爬坡試驗；Box-Behnken試驗

中圖分類號： TQ920.6文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0458-03

放線菌具有非常高的經濟價值，能產生多種多樣的抗菌物質。到目前為止，食品、工業、醫藥和農業上有許多成功的抗生素的使用實例[1]。從放線菌中提取有效的抗菌物質來抑制黃瓜枯萎病成為一條安全、有效的途徑，放線菌BOS-018的次級代謝產物對黃瓜枯萎菌有較明顯的抑制作用。放線菌發酵培養基和發酵條件的優化是工業生產中非常重要的，是從實驗室到工業生產中不可缺少的環節[2]。響應面法在試驗設計中是一種常用方法，準確、高效且分析性強[3-4]。本實驗運用響應面法中的Plackett-Burman設計、最陡爬坡試驗、Box-Behnken設計來對BOS-018菌株的培養基配方和培養條件進行優化，應用Design-Expert.V.8.0.6軟件對條件進行二階數值模型分析，獲得回歸方程，效果顯著[5]。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株供試菌株：放線菌菌株BOS-018 （從長白山針葉林土壤中分離、篩選并保存）。指示菌株：黃瓜枯萎病菌，由遼寧科技大學生物工程實驗室提供。

1.1.2培養基固體保存培養基：PDA培養基；液體發酵培養基：高氏一號液體培養基。

1.2方法

1.2.1菌株的活化和抑菌物質的測定將實驗室保存的BOS-018菌種接種于高氏一號斜面固體培養基上，在28 ℃恒溫培養箱中培養7 d，進行菌株活化。然后用接種環將菌種從斜面培養基接到250 mL三角瓶中，三角瓶中放入液體發酵培養基，然后放置在恒溫振蕩器上振蕩培養，振蕩器溫度為28 ℃，轉速為140 r/min。將放線菌菌株BOS-018接種于高氏一號液體發酵培養基中進行發酵培養，根據不同的發酵培養條件培養后，將菌液在無菌條件下離心15 min，離心條件為4 000 r/min。然后把無菌濾紙片在離心所得的上清液中浸泡3 min后置于已接種黃瓜枯萎病菌的PDA培養基平板中央，于28 ℃條件下恒溫培養7 d后，再分別測量抑菌圈直徑，確定最佳發酵條件[6]。

1.2.2響應面法優化發酵條件

1.2.2.1單因素試驗采用單因素試驗依次對培養基、發酵溫度、發酵時間、裝液量、接種量、pH值等液體發酵工藝參數進行逐一優化。每個處理重復3次，平均3次試驗的值。然后按照上面的方法對致病真菌進行抑菌試驗，找到能產生最大抑菌圈的單因素發酵培養基和培養條件。

1.2.2.2Placket-Burman（P-B）設計試驗[7]在單因素試驗的基礎上，選取N=9的P-B試驗進行設計，將影響 BOS-018 發酵的9個因素作為P-B設計的主要成分。將高水平（1）設定為低水平（-1）的1.25～1.50倍，抑菌圈直徑作為響應值Y。表1為P-B設計試驗。數據采用 SPSS 17. 0 統計軟件進行統計處理，分別對數據作單因子方差分析，以P<0.05 表示差異顯著。選出影響抑菌圈直徑的3個顯著因子。

1.2.2.3Box-Behnken（B-B）試驗設計在單因素試驗及P-B試驗的基礎上，選取對整個發酵模型影響最大的3個顯著因子進行響應面分析，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行Box-Behnken試驗設計，每個因素3個水平，5個重復的中心點。響應面分析試驗以顯著因素為自變量，以抑菌圈直徑為響應值，來確定各因素對致病真菌的影響。

1.2.3[JP3]模型的驗證試驗為了進一步驗證響應面法所得預測值，將優化后所得最佳預測值進行發酵試驗，每個試驗均設3個重復，取平均值。比較試驗所得值和預測值，來確定采用響應面法優化得到的發酵條件是否準確可靠、是否具有實用價值。

2結果與分析

2.1Placket-Burman試驗結果與分析

Placket-Burman試驗數據見表2，表中數據采用SPSS 17. 0 統計軟件進行統計處理后，得到各因素的主要效應和顯著性，結果見表3。由表3可知，影響液體發酵的3個最顯著因素分別是溫度、接種量和裝液量，它們的Pr值均小于005，說明這個回歸模型是具有統計學意義的，這3個因素的影響都是顯著的。

2.2最陡爬坡試驗結果與分析

由Plackett-Burman試驗能夠看出，放線菌BOS-018液體發酵條件優化中溫度、接種量、裝液量3個因素對抗生素的產量有顯著影響，其中溫度和接種量有顯著的正效應，應增加，裝液量有顯著的負效應，應減少。根據3個因素效應大小比例以及方程中各變量的系數關系設定它們的變化方向及步長進行試驗[8]

2.3Box-Behnken試驗結果與分析

根據Plackett-Burman試驗和最陡爬坡試驗來確定試驗因素和水平。試驗與結果如表5。

通過Box-Behnken設計出17組試驗，見表6。按照試驗所得數據進行二次多項回歸擬合，預測出抑菌圈直徑最大值所對應的關鍵因子范圍[9]。

3結論

發酵培養基和培養條件的優化在微生物發酵產品產業化過程當中非常重要。Plackett-Burman （P-B） 試驗設計方法在微生物發酵培養基成分的優化和發酵工藝關鍵參數的篩選中被廣泛應用，可以快速有效地篩選出對目標值影響最大的關鍵因子[10-11]。

本試驗運用響應面法中的Plackett-Burman設計、最陡爬坡試驗、Box-Behnken設計來優化放線菌BOS-018的液體發酵條件。利用Plackett-Burman設計來確定顯著效應因素為培養溫度、接種量和裝液量。利用最陡爬坡試驗來確定3個顯著效應因子的變化方向和步長，Box-Behnken試驗確定最優值為培養溫度27.74 ℃，接種量13.26 mL，裝液量102.07 mL。模型預測的抑菌圈Y值為22.12 mm，驗證試驗結果為23 mm，相對誤差為3.82%。試驗結果表明模型預測與驗證試驗結果基本一致，用該模型可以合理、有效地預測Y值，為進行工業化生產奠定基礎。

參考文獻：

[1]馮軼男，楊潤清. 放線菌分離與篩選方法的研究進展[J]. 生物技術，2010，20（4）：95-97.

[2]代志凱，張翠，阮征. 試驗設計和優化及其在發酵培養基優化中的應用[J]. 微生物學通報，2010，37（6）：894-903.

[3]褚以文. 微生物培養基優化方法及其 OPTI 優化軟件[J]. 國外醫藥：抗生素分冊，1999，20（2）：58-60.

[4]劉志祥，曾超珍. 響應面法在發酵培養基優化中的應用[J]. 北方園藝，2009（2）：127-129.

〖FQ（94/5。54，ZX，DY-W〗[KH4D]

[5]郝學財，余曉斌，劉志鈺，等. 響應面方法在優化微生物培養基中的應用[J]. 食品研究與開發，2006，27（1）：38-41.

[6]肖懷秋，李玉珍. 海金沙草總黃酮提取工藝的響應面優化[J]. 氨基酸和生物資源，2010，34（8）：68-72.

[7]楊銘. Minitab 用于中心復合設計與數據處理[J]. 藥學服務與研究，2007，7（3）：231-234.

[8]Xiao Z J，Liu P H，Qin J Y. Statistical optimization of medium components for enhanced acetoin production from molasses and soybean meal hydrolysate[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2007，74（1）：61-68.

[9]張榮勝，梁雪杰，劉永鋒，等. 解淀粉芽胞桿菌 Lx-11 生物發酵工藝優化[J]. 中國生物防治學報，2013，29（2）：254-262.[ZK）]

[10]Li Y，Jiang H，Xu Y，et al. Optimization of nutrient components for enhanced phenazine-1-carboxylic acid production by gacA-inactivated Pseudomonas sp. M18G using response surface method[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2008，77（6）：1207-1217.

[11]胡升，梅樂和，姚善涇. 響應面法優化納豆激酶液體發酵[J]. 食品與發酵工業，2003，9（1）：13-17.