漆酶基因異源表達及其酶活性的研究進展

劉曉慶， 那 日， 郭九峰

(1.內蒙古大學物理科學與技術學院，內蒙古呼和浩特 010021；2.內蒙古大學自治區離子束生物工程重點實驗室，內蒙古呼和浩特 010021)

?

漆酶基因異源表達及其酶活性的研究進展

劉曉慶1，2， 那 日2*， 郭九峰2

(1.內蒙古大學物理科學與技術學院，內蒙古呼和浩特 010021；2.內蒙古大學自治區離子束生物工程重點實驗室，內蒙古呼和浩特 010021)

漆酶(laccase，Ec1.10.32)屬于含銅的多酚氧化酶，能有效降解自然界中木質素等復雜有機物。真菌和植物中都可以分泌漆酶，少數的昆蟲和細菌也可以分泌漆酶，而真菌是漆酶的主要生產者。它通過獲得O2對苯酚物質進行催化作用，而生成物中僅有水。漆酶是一種不可多得的環保型氧化酶。漆酶是參與自然界木質素循環與利用的重要酶之一。漆酶對富含木質素的農作物殘渣的有效降解作用不僅可以減少秸稈焚燒帶來的環境問題，而且可以提高青貯飼料的品質和利用率，對與木質素結構相似的污染物也有明顯的降解能力。據統計，漆酶有作用底物250多種[1]1。漆酶的底物多樣性決定了它是一種多功能氧化酶。它在工業、農業及食品工業都有著極其廣泛的應用。近年來研究表明，漆酶在生物技術方面也有重要的作用，可用于生物傳感器與生物檢測。然而，野生菌株的漆酶活力比較低。自然界中絕大多數能夠生產漆酶的真菌都受到產量低、不易操作、成本高等因素的限制而難以適應商業化生產。漆酶高溫易失活，也阻礙了它的實際應用。如何生產廉價、高效率且活力高的漆酶越來越受到國內外眾多學者的關注。對漆酶基因進行改造，實現漆酶的異源高效表達是解決這一問題的有效途徑之一。筆者對近年來漆酶基因克隆異源表達及其酶活性研究的最新進展進行綜述。

1漆酶基因的克隆

隨著分子生物學的發展，人們對漆酶基因的研究已邁入分子水平。不同來源的漆酶基因得到克隆且進行了性質分析及鑒定。有研究表明，多種基因克隆技術已被用于漆酶基因的克隆。漆酶基因的克隆技術有聚合酶鏈式反應(PCR)、逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)、外顯子拼接技術、cDNA文庫技術、RACE技術、基因組文庫探針雜交篩選法、染色體步移技術和表達文庫抗原篩選法，其中應用廣泛的是RT-PCR技術。RACE技術和染色體步移技術是新型的技術手段，其中RACE技術是以RNA為模板，但是RNA在試驗過程中極易被污染降解，而且由于其技術主要是PCR擴增，所以可能出現堿基序列突變；染色體步移技術以DNA為模板，有效地避免了RNA易被降解這一缺點[2]。鄭苗苗[3]采用簡并PCR、RT-PCR、RACE、染色體步移方法從偏腫革裥菌的成熟菌絲中克隆得到漆酶同工酶cDNA全長基因。1988年Frohman等[4]最早利用cDNA快速擴增技術將poxI基因成功克隆。隨后，很多研究者采用RT-PCR技術克隆得到漆酶基因。隨著基因克隆技術的不斷發展，很多新型基因克隆技術與策略也被用于漆酶基因的克隆。洪宇植[5]將漆酶保守序列引物擴增法與長距離反向PCR技術相結合，建立了一種漆酶基因的新型克隆體系，高效擴增出野生革耳漆酶的DNA片段的側翼序列。該方法較傳統的反向PCR高效、簡便、特異，能夠解決擴增片段短、假陽性多的不足[7]。也有學者將RT-PCR和RACE技術相結合，克隆到灰樹花漆酶基因[6]。不同來源的漆酶保守性較低，但是銅離子結合區相對保守。鄭邦曉等[7]通過保守引物CuI和CuIV從Cerrena spHYB07中克隆出包括CuI和CuIV保守結合位點在內的1 587 bp的保守序列，再用TAIL-PCR方法克隆側翼序列。漆酶具有高度保守的銅離子結合區和N末端糖基化位點。路運才等[8]根據漆酶基因的這種特點，利用同源克隆技術，在玉米的基因中找到與黑麥草漆酶基因的同源片段，并且成功克隆。這為玉米漆酶全長的克隆及對飼用玉米的改良奠定基礎。馮寶珍等[9]利用同源克隆法，從辣椒疫酶基因組克隆了漆酶基因Pclac3。該基因與已知真菌漆酶具有較高的同源性，也具有漆酶基因的保守序列。孫靜[10]7采用大量重疊的引物，并且通過基于兩步PCR的DNA合成法(PDTS)進行GILCC全基因的合成。該方法簡單且易操作，不需要對引物進行磷酸化處理，而且可以較便利地獲得大量的引物。此外，還有很多學者通過建立基因組文庫或cDNA文庫，采取設計探針篩選基因的方法克隆基因。Coll等[11]運用基因組文庫和cDNA文庫克隆到擔子菌PM1漆酶基因。

2漆酶基因表達載體的構建和轉化

基因表達載體的構建需先用同一種限制酶分別切割目的基因和質粒，再用DNA連接酶將二者連接，形成DNA分子,然后將目的基因轉入受體細胞。常用的受體細胞有大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌和動植物細胞等。漆酶基因進行異源表達時通常采用微生物作為受體細胞。這是因為它繁殖快，遺傳物質相對較少。據報道，應用于漆酶遺傳轉化的方法有PEG介導的原生質體轉化、電激轉化、基因槍轉化、限制性內切酶介導轉化、農桿菌介導轉化[12]。其中，最常用的為電激轉化法。該方法具有簡便、快速、轉化效率高等特點。洪玉[13]利用隨機插入策略，用瑞氏木霉的編碼基因cbh1啟動子pcbh1控制栓菌漆酶基因LacA構建基因表達載體PCGlacA，直接隨機整合入瑞氏木霉中進行異源表達。孫靜等[10]13-14將帶有GILCCI的基因的表達載體pYM7909通過點擊轉化的方法轉化進酵母細胞內。

3漆酶基因的異源表達

近年來，隨著分子生物學技術的發展，多種來源的漆酶基因已得到克隆，并在不同的宿主細胞中成功表達。目前為止，漆酶的異源表達宿主細胞既有原核生物又有真核生物，而真核宿主細胞占主要地位。其中，作為漆酶基因的真核宿主細胞成功表達的有畢赤酵母(Pichiapastoris)、釀酒酵母(Brewer’s yeast)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)[14]、銀耳芽孢(Tremellaspore)、絲狀真菌瑞氏木霉(Trichodermareesei)等。有學者已將漆酶基因在煙草植物中成功實現異源表達[15]。目前，漆酶基因在原核細胞中實現表達的卻只有大腸桿菌(Escherichiacoli)和乳酸菌(Lactic acid bacteria)[16]。在該試驗前期，已成功實現漆酶在乳酸菌中的異源表達。目前，陽性重組子的酶學和產酸特性的研究工作尚在進行中。

畢赤酵母表達系統是目前使用最為廣泛的異源蛋白真核表達系統。大多數漆酶基因的異源表達都在酵母中完成。該表達系統不僅具有原核表達系統操作優點，而且具有真核表達系統的優質性[17]。由于酵母是單細胞生物，操作簡單而生長速度較快，可進行高密度發酵培養；酵母對培養基營養成分的要求低，生產成本低，便于工業化生產；畢赤酶母表達系統遺傳表達的穩定性較強；AOX啟動子控制下的外源基因能得到嚴格的高效表達；酵母不含病原體、熱原體和病毒包涵體，且具有真核細胞的翻譯后修飾功能，可對外源基因翻譯后進行正確的加工和修飾[18]。然而，畢赤酵母表達系統也有其局限性，如信號肽加工不完全等，但這不足以阻擋它成為最具優勢的異源表達系統[19]。

大腸桿菌表達系統是研究最早、應用最廣泛的原核生物表達系統，也是異源基因表達的重要工具。相對于真核表達系統，它具備以下優勢：①宿主的遺傳背景及其生理特性比較清楚，已有不同抗性的菌種可供選擇，易于控制[20]；②繁殖能力強而快，大規模生產成本低，具有巨大的工業化應用潛力。楊建強等[1]68-70首次嘗試將野生革耳漆酶基因在原核表達系統大腸桿菌中實現表達。這是首次報道真菌來源的漆酶基因在原核表達系統中成功實現表達。Salony等[21]將黑蛋巢菌屬(Cyathusbulleri)產生的漆酶成功地在原核宿主細胞大腸桿菌中實現異源表達。在密碼子偏好性使用頻率上，與枯草芽孢桿菌和畢赤酵母相比，大腸桿菌與漆酶的密碼子用法差異最小，因此大腸桿菌更適合作真菌漆酶的異源表達宿主細胞[22]。也有研究表明，在大腸桿菌系統中雖然能大量產生重組蛋白，但由于在這種系統中不能對重組蛋白進行二級結構修飾，所以重組蛋白沒有經過糖基化或空間修飾，進而失去酶活性[23]。

乳酸菌是益生菌，較其他宿主細胞而言是安全級的宿主細胞。它在表達外源基因的過程中不會產生內毒素，是近年發展起來的高效食品級異源基因表達的宿主細胞。自2007年以來，很少有漆酶基因在原核宿主細胞中成功表達。2014年，杏鮑菇漆酶基因成功地在原核宿主細胞乳酸菌中實現異源表達，其遺傳穩定性還有待探究。

植物也可以作為漆酶基因的異源表達載體。在植物中表達和分泌的漆酶能夠參與植物修復系統，而且能夠幫助土豆抵御細菌性病原體的侵害。漆酶基因在農作物中的表達可提高農作物抗性。2002年Li等[24]把土豆漆酶基因以35S啟動子控制接入西紅柿中，成功表達地轉基因西紅柿抗病性能明顯提高。上海生命科學研究院植物生理生態研究所實驗室將棉花的漆酶基因轉入擬南芥中實現過量表達。研究表明，轉基因擬南芥對酚酸類物質的抗性得到顯著增強。越來越多的研究者在實現漆酶基因異源表達的同時，期望能得到轉基因的植物或轉基因工程菌，不僅能解決漆酶產量的問題，而且能獲得具有漆酶功能的轉基因生物，為工業化生產奠定理論基礎。表1為近年來已實現異源表達的部分漆酶基因。

漆酶基因的克隆及序列分析的主要目的是實現漆酶的高效表達。真菌漆酶培養時間過長、過程易污染等條件限制難以實現工業化生產。利用基因工程技術獲得漆酶的高產菌株是實現漆酶高效表達的有效途徑。到目前為止，已有多種來源的漆酶成功實現異源表達，但還僅限于實驗室研究，未能投入到工業化生產。

并不是所有的漆酶基因轉入載體細胞后都能夠表達。2014年陽經慧[31]將從草菇中分離到的6個漆酶基因分別命名為vv-lac1、vv-lac4、vv-lac5、vv-lac6、vv-lac8、vv-lac9，電轉化入畢赤酵母中，對重組子進行酶活篩選，發現僅帶有vv-lac6的轉化子具有酶活。轉化后的重組子可以通過含有適量的愈創木酚或ABTS的平板培養基進行初篩，成功表達的重組子在含有愈創木酚的培養基中菌落周圍會出現微紅棕色，而在含有ABTS的培養基中菌落周圍會出現墨綠色。對于有顏色變化的菌落，可經過菌落PCR復篩。當PCR產物與目的基因相同時，表明漆酶基因成功表達。

表1　已實現異源表達的部分漆酶基因[25-30]

4漆酶活性的測定和分析

測定漆酶活性是評價重組子異源表達漆酶性能的常用方法。漆酶是單電子氧化酶，其作用底物非常廣泛。不同來源的漆酶對底物的親和力不同，因此漆酶作用底物有多種。按結構，漆酶可分為酚類及其衍生物、芳胺及其衍生物、羥酸及其衍生物、生物色素、金屬有機化合物、其他非酚類底物六類。測定漆酶活力的方法有測O2法(較早的測漆酶活力方法)、高效液相色譜法(HPLC法)、測壓法、微量熱法、脈沖激光光聲法、分光光度計法、級譜法等[32]。在這些方法中，被廣泛采用的方法為分光光度計法。該方法操作簡便、快捷，近年來受到眾多學者的青睞。

分光光度計法常見的作用底物有丁香醛連氮、苯胺藍、愈創木酚、(2，2-聯氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽)(ABTS)、鄰聯甲苯胺、二茂鐵。其中，以ABTS為底物測定漆酶的活性是目前國內外學者最常用的方法。ABTS易溶于水且反應只有一步，其陽離子自由基在水溶液中呈淺藍綠色且較穩定，漆酶分解ABTS的產物在420 nm處的吸光系數遠大于底物ABTS[33]10，其吸光系數為3.6×104L/(mol·cm)。以愈創木酚為底物時反應的時間較長，酶活力低，但反應較穩定。這與該反應的米氏常數較大有關。在465 nm處測定其吸光值，摩爾消光系數為4.8×104L/(mol·cm)，目前應用也比較廣泛。當以丁香醛連氮為底物時，酶活力較高，且由于丁香醛連氮的摩爾消光系數很大，達6.5×104L/(mol·cm)，靈敏度也很高，且抗干擾性好，但當底物和酶液量較大時，反應不太穩定，需以冰浴來終止反應，而酶活力會明顯低于不用冰浴時。 以鄰苯甲胺為底物時，酶活較低，而且該底物的水溶性不太好，故不宜采用。以二茂鐵為底物測定漆酶活性，準確度十分精準。這種檢測方法沒有多余的物質干擾，簡單，高效，但是在國內應用不高，所以不常被人們用作生物酶的活性檢測。

重組漆酶的活性除了與來源有關外，還受到溫度、pH、金屬離子濃度的影響。據報道，溫度、pH影響漆酶的表達,而Cu2+影響漆酶的表達活性。真菌漆酶最適pH隨著反應底物的不同而變化。多數真菌漆酶為酸性蛋白，最適pH一般在3.0～6.0之間。同一種來源的漆酶對不同反應底物的最適溫度也有差異。大多數真菌漆酶的最適反應溫度在40～60 ℃之間，但其耐熱性均較差。此外，大量研究表明，適當濃度的Cu2+對漆酶活性有較大的促進作用，而且能提高漆酶穩定性。若濃度過大，則漆酶活性反而下降。外界條件影響漆酶活性，其生物量并沒有發生變化。其他金屬離子如Mn2+、Na+、Zn2+、Ca2+、Fe3+、K+、Ba2+、Al3+、Fe2+、Mg2+等對漆酶活性均有一定的影響，但是不同的金屬離子對不同來源真菌漆酶活性的影響有一定的差異，即使同一種金屬離子對不同來源的漆酶作用也有不同[33]35-44。漆酶來源很多，序列多變，結構各異，導致不同來源的漆酶表現出來的催化特性如催化氧化能力、最適pH、底物專一性和穩定性相差較大。

雖然已有多種漆酶成功實現異源表達，但是大多數重組漆酶的產量低于1.0×104U/L，依舊難以滿足工業化生產需求[34]。重組漆酶活性較低，可能與宿主細胞的密碼子偏好性、信號肽的作用和培養條件等因素有關。表2為近年來已實現異源表達的部分漆酶重組子的活性。

表2　部分漆酶重組子的活性[35-37]

注：-表示文獻中未研究。

Note:- stands for not research in literature.

5展望

漆酶是一種具有廣泛工業化用途的酶，是自然界中為數不多的木質素降解酶之一。漆酶的應用需要大量廉價且生產周期短的酶制劑。在自然界中，白腐真菌是漆酶的主要生產者，但野生型真菌的漆酶產量較低，培養周期長，因此限制了漆酶的大量生產和廣泛應用，難以滿足工業化的生產。如何實現漆酶的高效表達越來越受到國內外學者的重視。隨著分子生物技術和基因工程的快速發展，在分子水平上研究漆酶逐漸發展起來。國外對漆酶分子學研究得比較深入。很多種漆酶基因得到克隆，并且對其進行了分析和鑒定。目前，已有一些不同來源的漆酶在異源真核和原核系統中實現表達。研究漆酶異源表達，探究如何實現漆酶異源高表達，為漆酶大規模的生產和廣泛應用提供理論依據，使得漆酶向工業化生產又邁進了一步。但是，目前漆酶的異源表達仍不理想，還未能真正實現漆酶的高效表達且達到工業化生產需求，還需要更進一步的研究。加強分子生物學和分子遺傳學鄰域的研究，更深入地了解漆酶基因的結構、功能，進而實現在基因水平對漆酶進行改造和優化，真正實現漆酶的高效異源表達。

參考文獻

[1] 楊建強.革耳(Panusrudis)漆酶的異源表達和酶學性質改良[D].長春：中國人民解放軍軍事醫學科學院, 2005.

[2] 郝鑫.桑黃漆酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達[D].長春：吉林農業大學, 2014.

[3] 鄭苗苗.偏腫革裥菌漆酶基因克隆及在畢赤酵母中的表達[D].哈爾濱：東北林業大學, 2012.

[4]FROHMAN M A，DUSH M K，MARTIN G R.Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer[J].Proc Natl Acad Sci USA,1988,85(23):8998-9002.

[5] 洪宇植，肖亞中，房偉，等.長距離反向PCR技術高效擴增已知DNA片斷的側翼序列[J].激光生物學報,2006(1):46-49.

[6] 鄭苗苗，池玉杰，邵淑麗，等.灰樹花漆酶基因及啟動子克隆和序列分析[J].西南農業學報，2014(2):606-612.

[7] 鄭邦曉，余湘萍，葉秀云，等.齒毛菌漆酶的基因克隆、異源表達及脫色研究[J].福州大學學報(自然科學版)，2015(2):285-292.

[8] 路運才，TORBEN A，SCHEJBEL B，等.基于同源克隆技術分離玉米漆酶基因片段[J].玉米科學，2007(2):9-13.

[9] 馮寶珍，李培謙，劉麗華.辣椒疫霉漆酶基因Pclac3克隆表達[J].山西農業科學，2014(1):1-5.

[10] 孫靜.畢赤酵母異源表達靈芝漆酶及酶學特性與功能的研究[D].揚州：揚州大學， 2011.

[11] COLL P M，TABERNERO C， SANTAMARIA R,et al. Characterization and structural analysis of the laccase I gene from the newly isolated ligninolytic basidionycete PM1 (CECT2971)[J].Appl Environ Microbiol，1993,59(12):4129-4135.

[12] 董曉雅.平菇遺傳轉化體系和轉漆酶工程菌株的構建[D].鄭州：河南農業大學, 2010.

[13] 洪玉.利用隨機整合和基因置換策略在瑞氏木霉中異源表達栓菌漆酶的研究[D].濟南：山東大學, 2014.

[14]石振飛.糙皮側耳漆酶基因的克隆及在粟酒裂殖酵母中的表達[D].長春：吉林農業大學, 2013.

[15] CHIAIESE P，PALOMBA F，GALANTE C,et al.Transgenic tobacco plants expressing a fungal laccase are able to reduce phenol content from olive mill waste waters[J].Inter national journai of phytorem ediation，2012, 14(9):835-844.

[16] 薛丹.食用菌中漆酶基因的克隆及乳酸菌電激轉化體系的建立[D].呼和浩特：內蒙古大學, 2014.

[17] 王冶，鄭甲，唐詩哲，等.外源蛋白在巴斯德畢赤酵母中高效分泌表達的前沿技術[J].基因組學與應用生物學,2014(3)：689-694.

[18] 韓雪清，劉湘濤，尹雙輝.畢赤酵母表達系統[J].微生物學雜志，2003(4):35-40.

[19] 劉元金.杏鮑菇(Pleuroruseryngii)漆酶基因的克隆及其異源表達研究[D].鄭州：河南農業大學, 2009.

[20] 戎晶晶，刁振宇，周國華.大腸桿菌表達系統的研究進展[J].藥物生物技術，2005(6):416-420.

[21] SALONY N G R B.Laccase ofCyathusbulleri:Structural, catalytic characterization and expression inEscherichiacoli[J].Biochimica et biophysica acta，2008,1784(2):259-268.

[22] 段慶虎，張應香，龔鳳萍，等.真菌漆酶基因的密碼子偏好性分析[J].江西農業學報，2015(5):65-70.

[23] 潘程遠.雞樅菌與淡色庫蚊及家蠅中漆酶編碼基因的克隆與表達[D].杭州：浙江大學, 2009.

[24] LI L, STEFFENS J C.Overexpression of polyphenol oxidase in transgenic tomato plants results in enhanced bacterial disease resistance[J].PLANTA,2002, 215(2):239-247.

[25] 裴佐蒂.灰蓋鬼傘漆酶在畢赤酵母中的異源表達及其酶學特性分析[D].上海：上海海洋大學, 2013.

[26] LI J F, HONG Y Z, XIAO Y Z, et al.High production of laccase B fromTrametessp. inPichiapastoris[J].World journal of microbiology & biotechnology，2007, 23(5):741-745.

[27] 盧磊.血紅密孔菌漆酶的純化及其基因在畢赤酵母中的表達[D].哈爾濱：東北林業大學, 2007.

[28] 歐陽鳳菊.芽孢桿菌漆酶基因的克隆表達與分子定向進化[D].哈爾濱：東北林業大學, 2014.

[29] 諶斌，唐雪明，沈微，等.粗糙脈孢菌漆酶基因的克隆及在畢赤酵母中的初步表達[J].食品與生物技術學報，2006(4):43-46.

[30] 周選圍.靈芝木質素降解酶系相關基因的克隆與酵母表達[D].上海：上海師范大學, 2014.

[31] 陽經慧.草菇漆酶基因異源表達的研究[D].楊凌：西北農林科技大學, 2014.

[32] 張鵬.以ABTS為底物測定漆酶活力的方法[J].印染助劑，2007(1):43-45.

[33] 陶亮亮.重組里氏木霉產耐高溫漆酶的研究[D].杭州：浙江大學, 2014.

[34] 周宏敏，洪宇植，肖亞中，等.栓菌漆酶在畢赤酵母中高效表達及重組酶的性質[J].生物工程學報，2007(6):1055-1059.

[35] 張銀波，姜瓊，江木蘭，等.金針菇漆酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達研究[J].微生物學報，2004(6):775-779.

[36] 李琦.變色栓菌漆酶同工酶基因克隆表達及其在染料脫色中的應用[D].南京：南京林業大學, 2013.

摘要近年來由于漆酶在生物漂白和農作物秸稈利用等方面具有廣闊的應用前景，對漆酶的研究越來越受到國內外學者的重視。然而，自然界漆酶的產量和酶活較低，難以適應工業化生產需求。此外，漆酶的產酶效率低，成本高。實現漆酶的異源高效表達是解決這一問題的有效途徑。目前，國內外已有多種來源的漆酶基因被成功克隆，并在不同的宿主細胞中實現異源表達，但迄今為止漆酶基因異源表達結果仍然不理想，離真正實現漆酶的高效表達還有一定距離。

關鍵詞漆酶；宿主細胞；異源表達；基因克??；酶活性

Research Progress of Laccase Gene Heterologous Expression and Enzyme Activity

LIU Xiao-qing1,2, NA Ri2*, GUO Jiu-feng2(1.School of Physical Science and Technology, Inner Mongolia University, Hohhot, Inner Mongolia 010021; 2.Key Laboratory of Ion Beam Biotechnology, Inner Mongolia University, Hohhot, Inner Mongolia 010021)

AbstractIn recent years, due to laccase has broad application prospects in bio-bleaching and farming straw utilization, research of laccase has been paid more and more attention by domestic and foreign scholars.However, yield and enzyme activity of laccase in nature is difficult to meet the requirements of industrial production.Moreover, the production efficiency is low and cost is high, heterologous expression is an effective way for solving this problem.Currently, a variety of different sources of laccase gene are successfully cloned and expressed in different host cells.So far, the heterologous expression of laccase gene is still unsatisfactory, and there is a certain distance for realizing high efficient expression of laccase.

Key wordsLaccase; Host cells; Heterologous expression; Gene cloning; Enzyme activity

收稿日期2015-11-30

作者簡介劉曉慶(1991- )，女，山西長治人，碩士研究生，研究方向：環境生物物理。*通訊作者，教授，碩士生導師，從事環境生物物理方面的研究。

基金項目國家自然科學基金項目(51267014)。

中圖分類號S 188

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)01-018-04