骨髓細胞學結合流式散點圖雙向驗證進行微小殘留分析

張　斌，蔡艷霞，張素貞，房勝春，李玉芬(.河北北方學院附屬第一醫院檢驗科，河北 張家口 075000；.河北北方學院附屬第一醫院兒內科，河北 張家口 075000；3.河北北方學院附屬第一醫院門診部，河北 張家口 075000)

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·論著·

骨髓細胞學結合流式散點圖雙向驗證進行微小殘留分析

張斌1，蔡艷霞2，張素貞1，房勝春1，李玉芬3*(1.河北北方學院附屬第一醫院檢驗科，河北 張家口 075000；2.河北北方學院附屬第一醫院兒內科，河北 張家口 075000；3.河北北方學院附屬第一醫院門診部，河北 張家口 075000)

[摘要]目的采用流式細胞技術結合骨髓細胞形態學雙參數雙向驗證分析微小殘留病細胞。方法對微小殘留病檢測患者進行形態學與流式散點圖雙向驗證，分析微小殘留病細胞的特點。結果采用該方法分析的樣本陽性檢出率高且不易漏診。結論采用骨髓細胞學結合流式散點圖雙向驗證進行微小殘留分析，陽性檢出率高且漏診率低。

[關鍵詞]骨髓細胞；流式細胞術；治療結果

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.02.028

微小殘留病是指白血病經誘導化療獲完全緩解后或骨髓移植后，體內殘留有少量白血病細胞的狀態。當今對微小殘留病主要有基因檢測、流式細胞技術檢測等方法，各實驗室還沒有完全統一的分析方法及標準化操作，本實驗室近年來采取流式細胞技術及細胞形態學2項檢測相互驗證的方法，對微小殘留病進行分析，療效判斷標準按照張之南、沈悌主編的《血液病診斷及療效標準》第3版[1]?，F將本實驗室近年來對32例微小殘留病分析結果報告如下。

1資料與方法

1.1一般資料選擇我院2011—2013年急性淋巴細胞性白血病14例和急性非淋巴細胞白血病18例進行微小殘留病分析檢測的患者。分析評估獲檢測陰性者25例(M3 10例，M2 5例，M5 3例，B-ALL 7例)，陽性者7例(M3 3例，M5 1例，M2 1例，B-ALL 2例)。其中1例本實驗室分析陽性而北京某檢驗所單一流式分析陰性患者45 d后骨髓形態學檢測原始細胞7.5%為陽性骨髓復發，其余檢測陰性者停藥至今(>1年)未見1例復發。

1.2實驗室檢查

1.2.1流式細胞檢測對標本進行50~100萬個細胞以上多抗體組合檢測，其中髓系白血病主要包括CD3、CD5、CD7、CD19、CD14、CD64、CD34、CD38、CD13、CD33、CD16、CD11b、HLA-DR、CD15、CD117、MPO等，B淋系白血病主要包括CD3、CD5、,CD7、CD19、CD20、CD22、CD9、CD23、CD34、CD38、CD13、HLA-DR、MPO、CD79a等[2]。通過以上檢測觀察有無幼稚細胞跨系列表達、跨階段多表達和缺失表達，以及幼稚細胞發育停滯等現象[3]。

1.2.2細胞形態學觀察比對主要采取低倍鏡全片或大面積尋找幼稚細胞后轉高倍鏡進行幼稚細胞形態學評估。評估要點有：整體形態(有無多邊形、梭形、手鏡形等)、核漿比例失衡、核出芽、核腫脹等病態造血現象[4]。

2結果

對32例患者采用以上方法分析，所有檢測陰性者在低倍鏡下，多視野(至少50個有幼稚細胞視野)觀察未發現原始細胞形態不規則、大小不一、核漿比例不平衡，以及染色質腫脹、出芽現象，符合流式細胞散點圖原始細胞無任何跨系列、跨階段表達，CD34、CD38走向正常，無幼稚細胞停滯現象。如果有一項指標符合以上描述均視為微小殘留病分析檢測陽性。部分細胞形態學及流式散點圖結果，見圖1~6。

圖1所示細胞為檢測陽性細胞(原發M5)，此類細胞胞體中等形態似梭形，染色質疏松，染色質偏于一側，且有扭曲折疊，核仁明顯(瑞氏染色 ×1 000)

圖2所示細胞為檢測陽性細胞，此類細胞胞體較大，不規則，染色質疏松腫脹，核仁明顯，胞漿中可見分布不均勻、大小不等顆粒，且易見偽足(瑞氏染色 ×1 000)

圖3所示細胞為檢測陰性細胞，此類細胞胞體中等大小，形態規則，染色質疏松，核仁1~2個，無扭曲折疊、核出芽等現象(瑞氏染色 ×1 000)

圖4對應圖1 流式細胞，該病例原始細胞占1.65%，流式結果主要表達B淋巴細胞免疫標志CD19、CD10、HLA-DR，但其有異常系外表達CD64以及CD34 表達停滯現象，未有向CD38過度表達的痕跡

圖5對應圖2，該細胞群CD34向CD38過度發育散點圖有明顯斷裂走勢，另外幼稚細胞群既有髓系CD33表達又有淋系CD19的異常表達

圖6對應圖3，該細胞群表達幼稚淋巴細胞，未見異常表達

3討論

在評價微小殘留時，在形態學方面主要考慮原始細胞所占有核細胞比例，>5%為骨髓未見緩解，<5%為骨髓完全緩解。對于原始細胞的良惡描述很少或近乎沒有形態學工作者對其進行判斷，可能是由于形態學工作者專一從事其工作，未對流式細胞術或更多檢查手段進行對比研究，沒有人描述什么樣的原始細胞更趨向于正常細胞，什么樣的細胞可能趨向于惡性細胞。

3.1原始細胞形態在形態學診斷工作中，特別是原始細胞比例偏低時，絕對不應以原始細胞的比例進行骨髓報告的判斷，而應該以形態學特點加以分析，主要包括：①原始細胞的整體特點，有無形態各異的原始細胞，如多邊形、梭形、手鏡形及不規則形等；②細胞核的觀察，如有無核腫脹出芽、胞核偏于一側，同一標本中觀察多個原始細胞有無胞核形態各異(既有規整者又有其他者)；③細胞質的觀察，有無多邊形偽足、內外漿等現象。對于以上細胞的觀察診斷應主要分析其一致性，如果同一標本容易發現不一致細胞特點，應考慮非正常原始細胞存在，進而結合流式細胞分析結果及散點圖走向特點。

3.2流式細胞技術分析白血病相關的免疫表型主要包括以下4種類型：抗原跨系列表達、跨階段表達、過度表達及表達缺失[5]。許多研究表明，不能因為骨髓中不成熟細胞的量而判斷為微小殘留病陽性。正常的骨髓細胞沒有免疫標志異常高表達和異常低表達，只有異常免疫標志表達足夠顯著時才可被用于判斷微小殘留的細胞[6]。采用流式細胞技術分析微小殘留病，主要觀察原始細胞的發育走向，如在進行最少100萬個細胞分析的基礎上單獨設門進行原始細胞的分析，如發現有原始細胞CD34到CD38發育停滯或有斷裂現象及原始細胞跨階段表達(髓系CD16/11b，淋系CD20/22尤為重要)，要結合有無形態異常進而判斷其原始細胞的質量。在檢測跨系列表達時，并非要按照首發時原始細胞的表達進行分析，應該增加它系典型抗體。本研究中多次化療后檢測到的病理細胞表達情況并非與首發時表達完全一樣，如M3的患者檢測到在幼稚B淋巴細胞的表面表達CD64，同時形態學原始細胞形態各異，有核出芽等現象。Kern等[7]總結了文獻報道的1 400例新診斷和未治療AML患者的白血病相關免疫表型分布情況，結果顯示抗原跨系列表達者占23．5%，跨階段表達者占20.6%，過度表達者占36.1%，表達缺失者占19.8%，其中絕大多數檢測出的LAIP僅見于5%以下的患者。因此，建議采用較大的抗體組合及三色以上的MPFC分析進行LAIP的檢測。我們主張在進行髓系檢測的時候至少增加淋系CD19、CD7、CD79a；在進行淋系檢測的時候至少增加淋系CD13、CD33、CD64、MPO的檢測。

綜上所述，在分析微小殘留病樣本時至少結合形態學及流式細胞2項技術進行，2項技術相互印證地分析同一標本得出的結果更符合實際病情。但本研究樣本量較少，需增加樣本量進一步探討。

[參考文獻]

[1]張之南,沈悌.血液病診斷及療效標準[M].3版.北京:科學出版社，2007：106-115.

[2]王建中. 臨床流式細胞分析[M].上海：上?？茖W技術出版社,2006：344-345.

[3]王紅霞，朱蕓，王翠霞，等. 急性髓系白血病形態學診斷與免疫學分型[J]. 河北醫科大學學報，2007,28(4)：291-294.

[4]邱衛華，郭慶云，張英芬. 骨髓增生異常綜合征中病態造血的特點與鑒別診斷[J].河北醫科大學學報，2008,29(4)：584-586.

[5]Campana D，Coustan-Smith E. Detection of minimal residual disease in acute leukemia by flow cytomemy[J].Cytomemy,1999，38(4)：139-152 .

[6]王璐璐，王建中，屈晨雪，等. 八色流式細胞術檢測急性B淋巴細胞白血病微小殘留病方法的建立[J].中華檢驗醫學雜志，2012，35(5)：423-430.

[7]Kern W，Schoch C，Haferlach T，et al. Monitoring of minimal residual disease in acute myeloid leukemia[J]. Crit Rev Oncol Hematol,2005,56(2):283-309.

(本文編輯：劉斯靜)·研究快報·

[中圖分類號]R551.3

[文獻標志碼]B

[文章編號]1007-3205(2016)02-0222-04

通訊作者*。E-mail:zbzb612@126.com。

[作者簡介]張斌(1976-),男,河北張北人，河北北方學院附屬第一醫院副主任技師，醫學學士，從事血液病形態學診斷及流式細胞技術研究。

[基金項目]河北省醫學科學研究重點課題(20100482)

[收稿日期]2014-12-19；[修回日期]2015-01-13