MMP-9和Fascin蛋白在口腔扁平苔蘚中的表達及相關性研究

劉長歡，金　玲，丁麗娜，陳英新

(吉林大學口腔醫院VIP綜合科室，吉林 長春130021)

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MMP-9和Fascin蛋白在口腔扁平苔蘚中的表達及相關性研究

劉長歡，金玲，丁麗娜，陳英新*

(吉林大學口腔醫院VIP綜合科室，吉林 長春130021)

摘要：目的檢測MMP-9和Fascin蛋白在口腔扁平苔蘚中的表達情況，探討兩者在扁平苔蘚發病機制中的作用及相關性。方法采用免疫組化技術檢測MMP-9和Fascin蛋白在35例口腔正常黏膜組織、45例口腔扁平苔蘚和46例口腔鱗狀細胞癌組織中的表達。應用SPPSS軟件對實驗結果進行卡方檢驗和Spearman相關分析。結果MMP-9在口腔正常黏膜組織、口腔扁平苔蘚和口腔鱗狀細胞癌組織中的表達依次增高，表達率分別為11.4%(4/35)、66.7%(30/45)、89.1%(41/46)，組間差別有統計學意義(P<0.05)；Fascin在口腔正常黏膜組織、口腔扁平苔蘚和口腔鱗狀細胞癌組織中的表達率依次增高表達率分別為0%(0/35)、15.6%(7/45)、69.6%(32/46)，組間差別具有統計學意義(P<0.05)；且MMP-9和Fascin蛋白在扁平苔蘚中的表達呈正相關(r=0.427,P<0.05)。結論MMP-9和Fascin蛋白在口腔扁平苔蘚癌變的進展過程中起著重要作用，兩者之間起相互協同促進的作用。

(ChinJLabDiagn,2016,20:0011)

口扁平苔蘚(lichen planus，LP)是一種伴有慢性淺表性炎癥的黏膜角化異常性疾病，具有一定惡變潛能，其惡變率約為0.39%-3.02%[1]。研究表明[2,3]，在多種惡性腫瘤疾病中，Fascin蛋白和MMP-9均發揮重要作用，但目前尚缺乏兩者在OLP中表達及相關性的報導。本課題通過用免疫組織化學法檢測口腔正常黏膜組織、口腔扁平苔蘚和口腔鱗狀細胞癌組織中MMP-9和Fascin蛋白的表達，探討MMP-9和Fascin蛋白的表達及相關性在口腔扁平苔蘚發病中所起的作用。

1材料和方法

1.1標本來源

選取吉林大學口腔醫院VIP綜合科和口腔頜面外科 2011—2014年經病理科確診的活檢標本，其中45例OLP組織，46例口腔鱗癌組織，35例正常組織來源于口腔頜面外科及急診科外傷，把甲醛溶液固定后的黏膜組織進行石蠟包埋、固定制成石蠟片，以便進行免疫組化染色，切片風化后在顯微鏡下觀察。

1.2主要試劑

兔抗人基質金屬蛋白酶9多克隆抗體，小鼠抗人Fascin蛋白單克隆抗體，pv-6000 山羊抗兔小鼠IgGHRP聚合物，TrisEDTA修復液(pH8.0)，DAB kit(20x二管)，過氧化物封閉液均購于中杉金橋試劑公司。

1.3主要設備

石蠟切片機 (德國 LEICA)、組織包埋機( 日本OLYMPUS)、光學顯微鏡(日本OLYMPUS)

1.4實驗方法及步驟

采用免疫組化方法。石蠟塊連續切片，厚度為2.5 μm，常規二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，蒸餾水沖洗；將切片放入Tris/EDTA修復液(pH8.0)中，高溫高壓修復，冷卻至室溫，PBS沖洗；3%H2O2室溫下孵育10 min，以消除內源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗；滴加一滴一抗(小鼠抗人Fascin蛋白單克隆抗體為成品液；兔抗人基質蛋白酶9多克隆抗體1∶200稀釋)在濕盒中孵育1個 h;PBS液沖洗;滴加一滴pv-6000 山羊抗兔小鼠IgGHRP聚合物，室溫孵育30 min；PBS液沖洗；DAB顯色(A,B液1∶20混勻)；顯微鏡下觀察5-7 min；蘇木精復染；返藍；梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠固封，光學顯微鏡觀察并攝片，測定陽性細胞數。用已知的MMP-9和Fascin蛋白陽性的口腔鱗癌標本作為陽性對照，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.5結果評定

評分法 每張切片由2名病理科醫師在顯微鏡下獨立雙盲觀察結果，染色陽性以細胞漿或胞膜呈現棕黃或棕褐色為標準，按半定量方法判定其表達強度。根據細胞著色強度分為：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；每張切片隨機選擇10個400倍視野計算細胞總數和陽性表達的細胞個數，得出細胞表達百分率：無陽性細胞為0分，陽性細胞熟占1%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，>75%為4分。兩項結果相加：0-2分為陰性，≥3分者為MMP-9陽性。

1.6統計方法

應用 SPSS20.0統計軟件。各組陽性率差異比較采用行×列表χ2檢驗，α=0.05。

2結果

MMP-9在正?？谇火つご蠖喑赎幮员磉_或少量表達；MMP-9在口腔扁平苔蘚組織主要在上皮細胞細胞膜或胞漿中表達,陽性細胞胞漿或胞膜呈棕黃色或棕褐色;陰性細胞胞漿、胞膜不著色，胞核呈藍紫色；MMP-9的陽性細胞在口腔鱗狀細胞癌中表達顯著增強，在基底膜附近的腫瘤細胞和癌巢染色更為顯著，呈棕褐色，癌巢周圍間質也有中等程度的染色。MMP-9在口腔正常黏膜、口腔扁平苔蘚、口腔鱗癌中的表達陽性率分別為 11.4%，66.7%，89.1%，組間差別具有顯著意義(P<0.05)見表1;圖1-3；Fascin蛋白在口腔正常黏膜中不表達或者少量表達；在扁平苔蘚Fascin主要定位在上皮基底層具有惡變潛能的基地細胞細胞質和胞膜中，呈棕黃色染色，且其染色強度明顯高于正常對照組，而在口腔鱗狀細胞癌中，主要表達在癌細胞的胞漿和胞膜中，尤其在癌巢的浸潤邊緣，表達更為明顯，而鱗狀細胞珠則為陰性，染色強度明顯高于正常組織和扁平苔蘚，其表達率分別為0%，15.6%，69.6%，組間差別具有顯著意義(P<0.05),見表2，3；圖4-6。

表1　MMP-9在正?？谇火つ?、口腔扁平苔蘚、

注：●口腔扁平苔蘚與正常組織比較；■口腔鱗狀細胞癌與正常組織比較；▲口腔扁平苔蘚與口腔鱗狀細胞癌比較

表2　Fascin蛋白在正?？谇火つ?、口腔扁平苔蘚、

注 ：●口腔扁平苔蘚與正常組織比較；■口腔鱗狀細胞癌與正常組織比較，；▲口腔扁平苔蘚與口腔鱗狀細胞癌比較

圖1　MMP-9在正常組織中的表達(SPx400)　　 圖2　MMP-9在扁平苔蘚中的表達(SPx400)　　圖3　MMP-9在鱗癌中的表達(SPx400)

圖4　Fascin在正常組織中的表達(SPx400)　　圖5　Fascin在扁平苔蘚中的表達(SPx400)　　圖6　Fascin在鱗癌中的表達(SPx400)

表3　口腔扁平苔蘚中MMP-9和Fascin蛋白表達的相關性

注：Spearman等級相關性分析，MMP-9和Fascin蛋白在扁平苔蘚中的表達相關系數r=0.427，P<0.05,具有統計學意義。

3討論

口腔癌的發病機理是一個多步驟、多因素的過程，其中包括從正常黏膜到單純增生、異常增生、原位癌最后發展成浸潤癌的一個連續的病理過程?？谇槐馄教μ\是臨床上一種常見的口腔黏膜病，已被確切證實是一種癌前病變，其惡變率約為0.39%-3.02%,對其發病機制的研究具有重要意義。

基質金屬蛋白酶家族(MMPs)是細胞外基質降解所必需的鋅離子依賴性內源性蛋白酶家族，是細胞外基質的主要生理性調節物質，能夠特異性的降解基底膜的成分[4]?；啄ぶ兄饕姆€定成分是Ⅳ型膠原，只有Ⅳ型膠原酶能降解IV型膠原成分，破環基底膜的完整性。MMPs家族中的明膠酶是唯一能夠降解細胞外基質(ECM)和基底膜(BM)中IV型膠原三螺旋結構的酶，其中MMP-9發揮最重要的作用[5]。

MMP-9少量存在于人體正常組織中，主要是惡性細胞在侵襲過程中分泌或誘導其周邊間質細胞產生的MMP-9破壞基底膜，基底膜Ⅳ型膠原的降解被認為是惡性細胞侵襲轉移的關鍵步驟，惡性細胞除了產生內源性MMP-9外，還能利用間質細胞合成MMP-9前體(酶原)，并提供合成新生物上皮細胞，因此，惡性細胞周圍的間質細胞產生MMP-9也與腫瘤侵襲和轉移有關[6]。大量研究已證實MMP-9在多種癌癥的浸潤轉移中發揮重要作用[2,7]，本實驗中MMP-9在正常黏膜、扁平苔蘚和鱗狀細胞癌表達逐漸增高，組間比較差異有統計學意義(P<0.0167)，證明口腔扁平苔蘚具有一定的惡變潛能，MMP-9在扁平苔蘚癌變的過程中發揮重要作用。

Fascin 蛋白屬于肌動蛋白結合蛋白家族中的一員，自20世紀70年代Opassiri等[8]從海膽卵母細胞的細胞質中發現并提純。人類Fascin基因定位于染色體7q22，最早從人類畸胎瘤中克隆，其編碼一種進化相對保守的細胞骨架蛋白，定位于細胞質張力纖維和細胞膜皺褶邊緣的絲狀偽足、微棘的核心肌動蛋白束中[9]。研究表明，Fascin在細胞的運動，黏附以及細胞的信息交流中擔任重要角色[10]。

Fascin在不同類型的細胞中表達具有差異性，在一些正常上皮組織來源的細胞中不表達或低表達，而在一些血管內皮細胞、神經膠質細胞中表達升高[11]近年來研究發現Fascin蛋白在許多上皮性腫瘤細胞中也表達上調，并與腫瘤侵襲及轉移有關，大量實驗研究表明Fascin蛋白的表達與腫瘤的分化增殖、細胞遷移及浸潤侵襲密切相關[3,12]，Fascin蛋白在正常組織、扁平苔蘚和口腔鱗癌中的表達依次增高，組間比較差異有統計學意義(P<0.0167)，表明口腔扁平苔蘚具有一定的惡變潛能，Fascin蛋白在扁平苔蘚癌變的過程中發揮重要作用。

綜上所述，國內外對MMP-9和Fascin的研究大多局限在惡性腫瘤，本實驗中MMP-9和Fascin在口腔鱗狀細胞癌均成陽性表達，與文獻報導結果一致[7,12]。而對其在扁平苔蘚等癌前病變中的表達及相關性研究鮮有報道，研究表明MMP-9和Fascin在扁平苔蘚發展為口腔鱗狀細胞癌的過程中發揮重要作用，且發揮協同作用(r=0.427,P<0.05),因此以MMP-9和Fascin蛋白為靶點等分子水平治療，可能為扁平苔蘚的治療提供新思路。但兩者在OLP惡變發生發展中具體的作用機制仍需要進一步的研究。

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關鍵詞：口腔扁平苔蘚；MMP-9 ；Fascin蛋白；免疫組化

Expression and correlation of MMP-9 and Fascin in oral lichen planusLIUChang-huan,JINLing,DINGLi-na,etal.(DepartmentofVIP,StomatologyHospitalofJilinUniversity,Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveTo examine the expression and correlation of MMP-9 and Fascin in oral lichen planus(OLP).MethodsThe expression of MMP-9 and Fascin in 35 cases of normal oral mucosa,45 cases of oral lichen planus and 46 cases of oral squamous cell carcinoma(OSCC) was examined by immunohistochemical technique.The data was analyzed by SPSS,a exact test using software package.Resultsthe expression of MMP-9 in normal oral mucosa,oral lichen planus and oral squamous cell carcinoma rises in turn.The positive rate respectively is 11.4%(4/35)、66.7%(30/45)、89.1%(41/46)，the comparison among groups is statistically significant(P<0.05);The expression of Fascin in normal oral mucosa,oral lichen planus and oral squamous cell carcinoma rises in turn.The positive rate respectively is 0%(0/35)、15.6%(7/45)、69.6%(32/46),the comparison among groups is statistically significant(P<0.05);In oral lichen planus,the expression of MMP-9 is positively correlative with that of Fascin(P<0.05).ConclusionMMP-9 and Fascin not only respectively paly an important role in cancerous progress of oral lichen planus but also the two factor work together to promote the cancerous progress.

Key words:oral lichen planus;MMP-9;Fascin;immunohistochemistry

(收稿日期：2015-03-10)

作者簡介：劉長歡(1989-)，男，吉林大學口腔醫學院研究生；陳英新，教授，碩士生導師，研究方向：口腔黏膜病。

文獻標識碼：A

中圖分類號：R446.62

文章編號：1007-4287(2016)01-0011-04

*通訊作者