Triptolide 抑制角膜免疫反應及TGF-β誘導角膜基質細胞膠原收縮實驗研究

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*并列通訊作者

Triptolide 抑制角膜免疫反應及TGF-β誘導角膜基質細胞膠原收縮實驗研究

高珣祎1,張文松2,張紅1,王玲1*，周鴻雁1*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 眼科，吉林 長春130033；2.吉林大學第二醫院 眼科)

雷公藤內酯醇(Triptolide，TP)是中藥雷公藤的一種成分，已證實具有多種藥理作用如抗炎、免疫調節等[1]。感染性角膜炎是世界范圍內，尤其是發展中國家的主要致盲性眼病之一。TNF-α作為Thl細胞分泌產生的炎性細胞因子之一，與IL-2、IFN-1等共同介導細胞免疫[2，3]，這些炎性因子及趨化因子可誘導炎性細胞對組織的浸潤功能?？梢?，角膜感染時，控制角膜炎性細胞浸潤及角膜炎癥反應是治療角膜炎的重要環節[4，5]。角膜基質中含有大量膠原蛋白，角膜膠原蛋白的正常代謝和結構對于維持角膜的通透性和形態有著關鍵作用。TGF-β可以促進多種細胞外基質的合成，促進Ⅰ 型膠原的轉錄、翻譯等機制，促進局部成纖維細胞增殖活化，這些與角膜瘢痕形成密切相關[6]。角膜膠原能維持角膜的正常形狀，如可抑制角膜膠原收縮量則可在角膜炎癥晚期膠原重塑過程中抑制角膜瘢痕的形成。本實驗我們通過測定每個皿中單個細胞釋放的TNF-α量，以及膠原直徑的量來探討TP對角膜免疫反應和角膜炎癥晚期瘢痕收縮的影響。

1材料和方法

1.1材料MEM,DPBS,膠原酶,蛋白酶，TP，TGF-β,Ⅰ型膠原。

1.2方法

1.2.1細胞采集新西蘭大耳白兔(重2.0-2.5 KG)來自吉林大學實驗動物中心，兔眼球摘除后用含抗生素DPBS水洗，機械方法去除角膜內皮及角膜上皮細胞，余下的角膜組織在37℃培養于含2 mg/mL dispase中1 h，并在collagenase(2 mg/mL,in MEM)37℃培養至獲得單層貼壁角膜基質細胞，然后獲得的角膜基質細胞用10% FBS 培養至第4-7代，用于實驗研究。角膜基質細胞三維培養：角膜基質細胞用胰蛋白酶消化，15,000 轉離心 5 min，用無血清培養液混懸，I型膠原，DMEM，0.26 M Na2CO3，0.2 M HEPES(pH 7.3)及角膜基質細胞混懸液在冰上按比例混合后放置于24孔板并在溫箱中培養至凝固，然后加入TGF-β及相關濃度TP，然后再放置于溫箱中培養不同時間。

1.2.2Triptolide對0.1 μg/ml LPS刺激U937巨噬細胞產生TNF-a的抑制作用實驗 將10萬U937巨噬細胞株培養于含10%FBS的RPMI1640中，經100Nm PMA 刺激培養48 h，使細胞貼壁，DPBS水洗，含10%FBS的RPMI1640換液，繼續培養24 h，吸出培養液，設計4個實驗組，分別是：單純加入0.1 μg/ml LPS組，僅含培養液的單純對照組，0.1 μg/ml LPS 聯合0.03,0.3，3 μM TP組，分別加入培養皿，培養于含1%FBS的RPMI1640中1 h，進行細胞計數，ELISA方法檢測每皿中單個細胞釋放的TNF-a量。

1.2.3TP對TGF-β 誘導角膜基質膠原收縮實驗的抑制作用實驗：實驗方法：兔角膜基質細胞培養于混合I型膠原的三維培養體系中，在培養體系中添加TGF-β1 μg/ml即可誘導角膜基質膠原收縮，膠原收縮的量由對膠原直徑的測量獲得。

2結果

2.1TP對0.1μg/mlLPS刺激U937巨噬細胞產生TNF-a的抑制作用實驗結果如圖1所示：TP可在濃度為0.3,3μM時抑制LPS刺激U937巨噬細胞產生的TNF-a量。

圖1　　TP對0.1μg/mlLPS刺激U937巨噬細胞產生

2.2TP抑制TGF-β誘導的角膜基質膠原收縮圖2示在添加TGF-β1μg/ml體系中，分別加入0.03,0.3,3μMTP，數據顯示Tp可抑制TGF-β誘導的角膜基質膠原收縮量，并呈劑量依賴關系。

圖2　　不同濃度的TP對培養體系角膜基質膠

2.3TP抑制TGF-β誘導的角膜基質膠原收縮圖3顯示，在TGF-β誘導的角膜基質膠原收縮模型中，在體系內添加及不添加3μMTP時，與對照組相比，添加組在第3天開始抑制膠原收縮量。

圖3　　3μMTp可在第3天開始抑制培養體系角膜基質

3討論

角膜炎是一種嚴重危害視力的眼科疾病。若診療不及時，可能導致角膜潰瘍、穿孔、眼內炎，嚴重者需行眼球摘除。角膜基質主要由細胞外基質(主要為Ⅰ型膠原纖維)和角膜基質細胞(角膜成纖維細胞)組成。當角膜受到外界刺激時，角膜免疫細胞被激活可以產生一系列細胞因子和趨化因子，可介導角膜細胞增殖、壞死以及炎性細胞浸潤角膜。角膜炎時角膜的主要病理特點是有大量的吞噬細胞浸潤和明顯的炎癥反應。LPS可誘導U937巨噬細胞產生TNF-α，TNF-α通過影響NF-κB的活性來作用與角膜免疫細胞產生細胞炎癥因子[7，8]。TGF-β可通過mTOR途徑和MAPK途徑誘導角膜肌纖維細胞形成[9，10]。

雷公藤是衛矛科一年生藤本植物，是我國一種傳統中草藥。TP是從雷公藤里提煉分離出的一種二萜內酯化合物，具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤等多種活性，TP有抑制炎癥細胞因子的分泌，以及抑制角膜肌纖維細胞形成的功效[11]，可能會有降低角膜炎癥反應和減輕角膜炎癥晚期瘢痕形成的功能。

本研究結果顯示LPS可以刺激U937巨噬細胞產生TNF-α，TP可以抑制U937巨噬細胞產生TNF-α的量，抑制的程度與加入TP的濃度呈正相關，表明TP可以作為對抗角膜炎癥反應的新型藥物。角膜基質膠原收縮模型中，在體系內添加及不添加3μMTP時，與對照組相比，添加組在第3天開始抑制膠原收縮量。在添加TGF-β1μg/ml的體系中，分別加入0.03,0.3,3μMTP，數據顯示Tp可抑制TGF-β誘導的角膜基質膠原收縮量，并呈劑量依賴關系。這樣的結果表明了TP對于抑制TGF-β介導的角膜膠原收縮有抑制作用，從而對于角膜炎癥晚期的瘢痕形成應有一定的抑制作用。

TP可通過抑制U937巨噬細胞產生的TNF-α量從而抑制角膜炎癥反應；TP對于TGF-β介導的角膜膠原收縮有抑制作用并呈劑量依賴關系，可以抑制角膜炎癥晚期的角膜瘢痕收縮，TP是有潛力的治療角膜炎癥性疾病的制劑。

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《中國實驗診斷學》雜志社聲明

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(收稿日期：2015-11-25)

文章編號：1007-4287(2016)01-0019-03

基金項目：國家自然科學基金(81300727)資助；吉林大學白求恩B計劃項目(吉林大學基本科研業務費2012230)