抑制miRNA-291b-3p表達對H9C2細胞胰島素信號通路活性的影響

李雪杰，隋小芳，王鳳玲，索樹珍，楊　軍,董文崴，張磊藝

(1.佳木斯大學老年醫學研究生；2.佳木斯大學附屬第一醫院 老年病科；黑龍江 佳木斯154002；

3.佳木斯大學附屬第一醫院 心內科)

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抑制miRNA-291b-3p表達對H9C2細胞胰島素信號通路活性的影響

李雪杰1，隋小芳2*，王鳳玲2，索樹珍1，楊軍3,董文崴3，張磊藝3

(1.佳木斯大學老年醫學研究生；2.佳木斯大學附屬第一醫院 老年病科；黑龍江 佳木斯154002；

3.佳木斯大學附屬第一醫院 心內科)

摘要：目的本文探討抑制miRNA-291b-3p表達在大鼠心肌細胞胰島素抵抗中的作用，并分析其可能的作用機制。方法①構建miR-291b-3p mimics 和inhibitor 腺病毒載體，感染H9C2細胞48 h，分析miR-291b-3p 水平、AKT/GSK 信號通路活性和糖原水平的變化。②TNF-α刺激心肌細胞24 h后，再用miR-291b-3p inhibitor 腺病毒載體感染H9C2細胞24 h，檢測AKT/GSK信號通路活性和細胞糖原水平，驗證TNF-α通過影響miR-291b-3p表達水平導致心肌細胞胰島素抵抗。結果①miR-291b-3p inhibitor腺病毒感染H9C2細胞48 h，miR-291表達水平降低，AKT/GSK信號通路活性升高，心肌細胞糖原水平降低；②低表達miR-291b-3p能夠逆轉TNF-α引起的AKT/GSK通路活性和糖原水平降低。結論低表達miR-291b-3p可促進AKT/GSK 信號通路活性，并改善TNF-α引起的胰島素抵抗。

(ChinJLabDiagn,2016,20:0025)

近年研究表明，胰島素抵抗不僅是2型糖尿病的主要發病機制，糖耐量正常冠心病患者發病的獨立危險因素[1]，其機制可能與抑制心肌細胞葡萄糖攝取，改變心肌能量代謝有關。隨著對miRNAs的深入研究，越來越多的結果表明，miRNAs廣泛參與心血管系統的分化、發育生過程，并調節其生理病理過程[2]。不同miRNA涉及動脈粥樣硬化斑塊形成、心肌缺血/再灌注損傷、心肌纖維化及心肌肥大、血壓調節、心律失常等。miRNA將成為未來心血管病診斷及治療的全新靶點。

1材料與方法

1.1細胞及主要材料來源

大鼠心肌細胞株H9C2購自中國醫學科學院細胞庫。H-DMEM 培養基購自Invitrogen公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；TNF-α 購于美國Epitomics公司；一抗購自美國Cell Signaling Technology公司；二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。miR-291b-3p低表達腺病毒載體(AD-291b-3p inhibitor)構建與純化交由上海吉凱科技有限公司完成。肌、肝糖原檢試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2大鼠心肌細胞的培養

將H9c2細胞置于37 ℃、 5%CO2培養箱內，用含10%胎牛血清的H-DMEM培養基培養，在細胞達80%-90%豐度時，以0.25%胰蛋白酶消化，按1：3比例接種于新培養瓶中傳代或六孔板中用于實驗。

1.3細胞模型的建立

將細胞隨機分為四組并接種于6孔板中:陰性對照(NCi)組，AD-291b-3p inhibitor腺病毒感染(291i)組，TNF-α處理(291i+TNF-α)組，TNF-α對照(NCi+ TNF-α)組。

1.4miR-291b-3p表達檢測

收集上述前兩組處理后的細胞，應用實時熒光定量PT-PCR檢測。采用Trizol試劑提取細胞RNA，逆轉錄 miRNA合成cDNAR，反轉錄產物采用SYBR Green熒光定量試劑盒和熒光定量PCR儀行PCR。采用△循環閾值(Ct)法處理結果。引物設計如下：

引物名稱反轉錄引物序列5’-3’miR-291b-3pGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-TCGCACTGGATACGACACAAACU6GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-TCGCACTGGATACGACAAATATG

引物名稱PCR引物序列5’-3’miR-291b-3pGCAAAGTGCATCCATTTTGTTTGTU6GCGCTCGTGAAGCGTTCUniverseprimerGTGCAGGGTCCGAGGT

1.5觀察miR-291b-3p水平變化對胰島信號通路及糖原合成的影響

對上述AD-291b-3pinhibitor及其陰性對照、TNF-α處理及對照組，分別處理后，收集細胞，用細胞裂解液提取細胞總蛋白，Western blot檢測p-AKT、AKT、p-GSK、GSK水平；按肌、肝糖原檢試劑盒說明操作，檢測心肌細胞中糖原水平。

1.6統計學分析

數據處理應用SPSS 13.0統計軟件進行，采用t檢驗和單因素方差分析進行統計學分析?？尚艆^間為95%，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1低表達miR-291b-3p增強細胞AKT/GSK 信號通路活性

在H9C2細胞中，我們用AD-291b-3p inhibitor腺病毒感染H9C2細胞48 h。結果顯示miR-291b-3p表達水平明顯降低(圖1A)，AKT和GSK磷酸化水平升高，細胞中糖原水平顯著降低(圖1B，C)。由此可見，低表達miR-291b-3p能夠增強AKT/GSK信號通路活性。

A.miR-291b-3p的表達水平；B.糖原合成水平；C.western blot檢測AKT/GSK通路的蛋白水平(n=3,*P<0.5,**<0.01，***<0.001)

2.2抑制miR-291b-3p表達能夠逆轉TNF-α誘導的心肌胰島素抵抗

為了證明miR-291b-3p參與TNF-α誘導的胰島素抵抗，用10 ng/ml TNF-α處理24 h后，AD-291b-3p inhibitor腺病毒感染H9C2細胞48 h，提取細胞總RNA和蛋白，檢測AKT/GSK信號通路和糖原水平。 結果顯示，低表達miR-291b-3p能夠逆轉TNF-α對糖原水平的促進作用(圖2A)和對AKT/GSK信號通路活性抑制作用(圖2B)。由此，說明TNF-α通過調節miR-291b-3p表達水平而影響胰島素信號通路活性。

A.糖原合成水平；B.western blot檢測AKT/GSK通路的蛋白水平(n=3,*P<0.5,**<0.01，***<0.001)

3討論

目前，學者們主要關注肝臟、骨骼肌和脂肪胰島素抵抗的作用，少有對心肌細胞胰島素抵抗相關機制進行研究。而心肌細胞胰島素抵抗水平同心血管疾病的發生、發展及嚴重程度密切相關[1]。研究發現，急性心肌缺血時使用胰島素調節血糖代謝對心臟有保護作用，可減少心肌缺血/在灌注后的損傷[3]。因此改善心肌細胞胰島素敏感性對維護心肌正常生理功能具有重要作用，可以作為防治胰島素抵抗相關心血管疾病的手段。

有研究發現[4]，通過激活 PI3K/AKT 信號通路可促進骨骼肌細胞葡萄糖攝取。在我們先前研究中已證實TNF-α引起H9C2細胞中AKT/GSK信號通路活性，升高細胞中糖原水平，且過表達miR-291b-3p與TNF-α結果一致。越來越多的研究表明miRNA 能夠廣泛參與到胰島素信號通路[5]以及心血管疾病[6]的調控中，在冠心病發病機制的各個環節中miRNA都發揮作用[7]。miR-291b-3p[8]屬于miR-290家族，已有研究證實其參與肝臟胰島素抵抗的AKT/GSK信號通路，該家族位于染色體7上的2200 bp的堿基片段，可以調控各種細胞信號通路[9]。在本研究中，我們發現在H9C2細胞中過表達miR-291b-3p能夠抑制AKT/GSK信號通路活性，升高細胞糖原水平；在H9C2細胞中低表達miR-291b-3p能夠增強AKT/GSK信號通路活性，降低細胞糖原水平。說明miR-291b-3p能夠調節H9C2細胞發生胰島素信號敏感性。為了明確miR-291b-3p在TNF-α誘導的細胞胰島素抵抗中的作用，我們在低表達miR-291b-3p同時用TNF-α處理H9C2細胞，發現抑制miR-291b-3p表達能夠逆轉TNF-α引起的心肌細胞胰島素抵抗。進一步說明了，miR-291b-3p確實參與了TNF-α誘導的心肌細胞胰島素抵抗。

綜上所述，在心肌細胞模型上，通過抑制miR-291b-3p表達水平，可增加AKT/GSK信號通路活性，使細胞中糖原合成水平升高。我們將進一步尋找其作用靶基因，并完善體內實驗，為胰島素抵抗相關的心血管疾病的診斷及治療提供了新的思路。

參考文獻：

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[2]Ruiz,M.A.,Chakrabarti,s..MicroRNAs:The Underlying Mediators of Pathogenetic Processes in Vascular Complications of Diabetes[J].Can J Diabetes,2013.37(5):p.399.

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關鍵詞：心肌細胞；胰島素抵抗；miR-291b-3p；TNF-α

MiR-291b-3p regulates activation of insulin signal pathway in H9C2 cellLIXue-jie1,SUIXiao-fang2*,WANGFeng-ling2,etal.(1.Geriatrics,thefirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity,postgraduatestudent；2.DepartmentofGeriatrics,thefirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversityHeilongjiangJiamusi154002)

Abstract:ObjectiveOur study aims to identify the role of microRNA-291b-3p in myocardial insulin resistance and the molecular mechanisms.Methods①In order to inhibit miR-291b-3p,H9C2 was infected with AD-291b-3p inhibitor for 48 h.And the level of miR-291b-3p,activation of AKT/GSK pathway and the level of glycogen were analyzed.②H9C2 was treated with10 ng/ml TNF-α for 24 h and then infected with AD-291b-3p inhibitor for 48 h.And the level of miR-291b-3p,activation of AKT/GSK pathway and the level of glycogen were analyzed.Results①In H9C2 cells Infected with AD-miR-291b-3p inhibitor,the levels of miR-291b-3p and glycogen level were decresased and activation of AKT/GSK pathway was promoted.②Down-regulation of miR-291b-3p could revese TNF-α-induced insulin resistance.

ConclusionDown-regulation of miR-291b-3p increased activation of AKT/GSK pathway,and revese TNF-α-induced insulin resistance.

Key words:Myocardial cell,insulin resistance,miR-291b-3p,TNF-α

(收稿日期：2015-08-15)

文獻標識碼：A

中圖分類號：Q781

文章編號：1007-4287(2016)01-0025-04

*通訊作者

基金項目:黑龍江省自然基金面上項目(項目編號：H2015076)；黑龍江省中醫藥中青年科技攻關項目(項目編號：ZQG-055)；佳木斯大學研究生科技創新項目(項目編號：LM2015_013)