HA轉hGM-CSF HepG2疫苗對IL-6誘導HepG2細胞EMT的影響及機制

朱全杰，段曉明，何 蜜，劉海濤

（1.湖南師范大學附屬長沙醫院，長沙 410006；2.長沙市第四醫院消化內科，長沙 410006；3.湘潭市中心醫院腫瘤內科，湘潭 411100；4.湖南師范大學附屬長沙醫院，長沙 410006）

HA轉hGM-CSF HepG2疫苗對IL-6誘導HepG2細胞EMT的影響及機制

朱全杰1，段曉明2，何 蜜3，劉海濤4

（1.湖南師范大學附屬長沙醫院，長沙 410006；2.長沙市第四醫院消化內科，長沙 410006；3.湘潭市中心醫院腫瘤內科，湘潭 411100；4.湖南師范大學附屬長沙醫院，長沙 410006）

目的：探討HA轉hGM-CSF HepG2疫苗逆轉IL-6誘導HepG2肝癌細胞上皮-間質轉化（EMT）的機制。方法：體外用HA轉hGM-CSF HepG2疫苗共培養受IL-6刺激的HepG2細胞，采用Traswell遷移實驗，Westernblot、RT-PCR方法分別檢測疫苗處理前后HepG2細胞的增殖及侵襲能力的變化、EMT標志物E-cadherin、調控因子（p-Stat3、Twist）蛋白及E-cadherin mRNA、Twist mRNA表達變化情況。結果：①IL-6組較陰性對照組穿膜細胞數明顯增多，侵襲能力明顯增強，差異有統計學意義。②IL-6組較陰性對照組E-cadherin的表達水平降低，p-Stat3、Twist蛋白表達升高，差異均有統計學意義。③疫苗組的穿膜細胞數較其他三組明顯減少，侵襲能力下降，差異均有統計學意義。④轉染后的疫苗組較其他三組E-cadherin蛋白表達升高，而p-Stat3、Twist蛋白表達下降，且差異均有統計學意義。⑤疫苗組較其他三組E-cadherin mRNA表達上調、Twist mRNA表達下調，且差異均有統計學意義。結論：①IL-6能誘導HepG2細胞產生EMT現象。②60Co處理的轉hGM-CSF基因HepG2疫苗可能通過下調轉錄因子Twist 及Stat3的表達進而逆轉IL-6誘導HepG2細胞EMT。

肝癌；hGM-CSF 基因；上皮-間質轉化；腫瘤疫苗；IL-6

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，位居我國腫瘤死亡率第三位［1］，盡管當前肝臟外科的診療技術不斷提高，但有機會手術治療的患者仍不到30%；即使手術，3年復發率仍高達75%，究其原因主要是肝癌起病隱匿，轉移率高，多數患者就診時已是中晚期，且目前認為肝癌的發生發展是一個多基因，多途徑和多階段的復雜過程，發病機制尚不完全明確，這個肝癌綜合治療帶來了一定難度［2，3］。研究顯示在腫瘤細胞中JAK/STAT3 信號通路持續激活可促進腫瘤的發生發展；白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）通過激活STAT3，促進腫瘤細胞上皮－間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），增強腫瘤細胞對免疫系統的侵襲作用［4-6］。腫瘤細胞發生EMT后twist基因表達上調，E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達下調，p-stat3上調，使細胞黏附能力下降，侵襲和遷移能力增強［7］。在我們前期的研究中已證實HA納米載體轉hGM－CSF基因的HepG2 疫苗具有增強機體抗腫瘤免疫應答，降低免疫耐受，抗腫瘤的作用［8］。但具體機制仍不十分清楚，本研究主要通過將hGM－CSF基因轉染HepG2細胞，并制備成腫瘤疫苗，然后觀察其對IL-6誘導HepG2細胞EMT的影響及其可能的機制。

1 資料與方法

1.1 細胞培養與試劑HepG2細胞株由中南大學湘雅細胞庫饋贈。人IL-6購于Peprotech公司；羥基磷灰石購買于上海源葉生物公司；（Human）GM-CSF質粒購自于上海吉凱基因；一抗試劑：單克隆β-actin抗體購自于美國proteintech公司、單克隆抗體（E-cadherin、twist、p-stat3）均購自于美國abcam公司；二抗試劑均購自于美國proteintech公司；ranswell板（8 μm）購自Corning公司；ECL化學發光檢測試劑盒購于 Pierce公司；RNaseA購于中國上海碧云天生物公司；逆轉錄試劑盒、qRTPCR試劑盒購買于北京康為世紀公司。

1.2 IL-6誘導HepG2 EMT參照文獻［9］方法；將人肝細胞癌HepG2細胞用含10%小牛血清的RPMI-1640培養液常規培養，用PBS重懸細胞并調細胞密度為1×107/mL，在37℃、5%CO2孵箱中培養，胰酶消化、傳代，取對數生長期細胞實驗。IL-6組用含50 ng/mL IL-6孵育HepG2細胞24 h（IL-6組），陰性對照組則采用單純培養基培養24 h（陰性對照組），于倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化。

1.3 基因轉染及疫苗制備參照文獻［10］方法；將課題組構建的GV230-hGM-CSF 真核表達載體轉染至HepG2細胞株（重組質粒組），用含10%小牛血清的RPMI-1640培養液常規培養，PBS重懸細胞并調細胞密度為1×107/mL；取體外培養的轉入hGM-CSF基因的HepG2細胞，經亞致死劑量（10 Gy）的放射線間斷照射后制備成轉hGM-CSF基因的HepG2疫苗（疫苗組）；采用Western-blot和RT-PCR方法驗證兩種細胞hGMCSF基因的表達；篩選穩定轉染的細胞并擴增培養；以轉染空載質粒（空質粒組）及未經轉染的HepG2細胞（空白對照組）作為對照。

1.4 Transwell 試驗HepG2細胞的體外侵襲能力：在侵襲小室的上、下室之間鋪有用基質膠（matrigel）制備好的侵襲膜，取各組對數期細胞懸液用（0 ng/mL、50 ng/ mL，IL-6作用24 h），按100 μL每孔，接種于侵襲膜上，37℃、5%CO2培養24 h，擦去膜上細胞及基質膠，取膜、固定、結晶紫染色，顯微鏡下計算穿膜細胞數。每組細胞設3個復孔，重復3次實驗。

1.5 Western blot 法檢測Twist、E-cadherin 和Stat3蛋白的表達提取各組細胞蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。按照每孔50 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉膜，用5%脫脂奶粉的TBST封閉1h，一抗（β-actin 1：4000、E-cadherin 1：10000、twist 1：500、p-stat3 1：200000）4℃孵育過夜，TBST漂洗，二抗（1：3000），室溫孵育1h，TBST 漂洗3次，每次15min，ECL化學發光，采集圖像，每組實驗重復3次。

1.6 qRT-PCR 法檢測E-cadherin 和Twist mRNA的表達用PBS 洗滌各組細胞3次，向各孔加入1 mL RNAiso Plus，按說明書方法提取總RNA，吸取2 μL RNA溶液于石英比色皿中，用無酶水定容至100 μ L，紫外分光光度儀測A260 /A280的比值，重復3次，計算RNA 濃度（RNA濃度（ng/μL）=A260×稀釋倍數×40），以mRNA為模板將其逆轉錄為cDNA。以β-actin為內參基因，使用2－△△Ct法計算基因的相對表達水平，引物序列見（表1），引物由南京金斯瑞公司合成。

表1 PCR 引物序列

1.7 統計學方法數據經SPSS 19.0統計軟件處理。計量資料以“mean±SD”表示，兩組數據間比較采用t檢驗，多組數據間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較滿足方差齊性要求時用LSD，如不滿足方差齊性要求時采用Tambane，s T2，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IL-6誘導及轉染hGM-CSF基因后HepG2細胞侵襲能力的變化Transwell 顯示，IL-6組較陰性對照組侵襲能力明顯增強，IL-6組穿膜細胞數為（174.4± 6.3）個，而陰性對照組穿膜細胞數為（112.5±3.1）個，差異有統計學意義（P＜0.05）（見圖1）。轉染hGM-CSF基因后疫苗組較其他三組侵襲能力下降，疫苗組的穿膜細胞數為（61.4±3.6）個，分別與重組質粒組（83.6±6.0）個、空質粒組（169.4±5.2）個、空白對照組（171.4±5.6）個比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）（見圖2）。

圖1 IL-6誘導HepG2細胞后侵襲能力的變化（100×）：A IL-6組B.陰性對照組

圖2 轉染hGM-CSF基因對IL-6誘導HepG2細胞侵襲能力影響的變化（100×）：C.空白對照組D.重組質粒組E.空質粒組F.疫苗組

2.2 IL-6誘導及轉染hGM-CSF基因后HepG2細胞EMT標志物表達的變化

2.2.1 IL-6誘導后HepG2細胞EMT標志物表達的變化（表2）

表2 各組細胞p-STAT3、Twist 及E-cadherin 蛋白相對表達量比較

2.2.2 轉染hGM-CSF基因后HepG2細胞EMT標志物及相關調控因子的變化（表3）

表3 各組細胞p-STAT3、Twist 及E-cadherin 蛋白相對表達量比較

圖3 Western-blot法檢測IL-6誘導及轉染hGM-CSF基因后HepG2細胞EMT標志物表達的變化：1.陰性對照組 2.IL-6組 3.空白對照組 4.空質粒組 5.疫苗組 6.重組質粒組

2.3 轉染hGM-CSF基因后HepG2細胞Twist、E-cadherin mRNA相對表達的影響

表4 各組細胞Twist、E-cadherin mRNA 表達比較

圖4 qRT-PCR法檢測轉染hGM-CSF基因后HepG2細胞后E-cadherin、Twist mRNA相對表達

3 討論

越來越多的研究證實EMT可促進多種腫瘤細胞的轉移，如膀胱癌、原發性肝癌、結腸癌和惡性黑色素瘤等［11-13］。EMT最主要的分子標志是上皮細胞標記物E-Cadherin的表達下調，且E-Cadherin蛋白的表達缺少是上皮性腫瘤細胞侵襲的前提條件［9］。相關報道，IL-6可持續激活JAK/STAT3 信號通路，誘導腫瘤細胞EMT，促進腫瘤細胞的轉移和侵襲［14-15］。我們的研究顯示用IL-6處理HepG2細胞后，HepG2細胞間隙增寬，呈紡錘狀或長梭形，細胞核顏色變深，誘導HepG2細胞向間質表型轉變，這與吳暢等［9］的實驗結果一致。Traswell侵襲實驗證實經誘導的HepG2細胞侵襲能力明顯增強；在蛋白及基因表達水平，我們發現，用IL-6處理HepG2細胞后，STAT3磷酸化水平升高，并使相關轉錄因子Twist蛋白及基因表達上調，EMT相關標志蛋白E-cadherin蛋白及基因表達下調，這與宋瑩等［16］肝細胞生長因子誘導人肝癌細胞上皮間質轉化作用機制研究結果相似。以上結果表明IL-6確實具有誘導HepG2細胞發生EMT的作用，且使HepG2細胞侵襲能力明顯增強。

本實驗進一步的研究顯示將60Co處理的轉hGMCSF基因HepG2疫苗與經50 ng/ml IL-6處理的實驗細胞共培養24 h后，Traswell侵襲實驗顯示疫苗組較CON組、重組質粒組及空白對照組相比，其穿膜細胞數減少，提示轉染后細胞侵襲能力下降；Western-blot實驗顯示疫苗組較CON組、重組質粒組及空白對照組E-cadherin蛋白表達升高，而p-Stat3、Twist蛋白表達下降，且RT-PCR實驗顯示疫苗組較另外三組E-cadherin mRNA表達上調、Twist mRNA表達下調，這與隋強君等［17］在阻斷肝癌細胞STAT3信號通路激發機體抗腫瘤免疫應答作用機制研究結果相似。還有研究顯示活化的STAT3 信號參與Twist、E-cadherin蛋白表達，調控EMT過程，并介導肝癌的侵襲與轉移，p-STAT3/Twist/ E-cadherin 信號軸異?？赡軐е赂伟┎∪祟A后差［18-20］。相關研究證實Th1/Th2細胞的偏移在EMT中發揮重要作用［21，22］。本課題組前期已證實該疫苗能通過增加HepG2 細胞免疫原性，誘導Th1 漂移，促進PBMC增殖、分化，干擾Th2類細胞因子如lL-6等對CD4+T 細胞調節，增加INF-γ的分泌，提高其對HepG2 細胞的殺傷作用［8］。而我們的實驗證實轉hGM-CSF基因HepG2疫苗與IL-6共培養的HepG2細胞后p-Stat3、Twist蛋白表達下降，Twist mRNA表達下調，提示IL-6/ p-STAT3/Twist信號軸被抑制。因此我們認為HA轉hGM-CSF的HepG2細胞疫苗可能通過增強免疫應答，誘導Th1漂移，阻斷JAK/STAT3信號轉導，下調Twist的表達，逆轉IL-6誘導HepG2細胞EMT，抑制肝癌的侵襲和轉移。

綜上所述，IL-6能促進HepG2細胞向間質細胞表型轉變，而轉hGM-CSF的HepG2細胞疫苗可通過阻斷JAK/STAT3信號通路逆轉肝癌HepG2細胞EMT，為肝癌的免疫治療提供新思路，但其具體機制還有待進一步研究。

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The effect of HepG2 tumor vaccine transfected hGM-CSF gene mediated by HA nanoparticles on inducing HepG2 cells epithelial-mesenchymal transition through IL-6

Zhu Quan-jie1, Duan Xiao-ming2, He Mi3, Liu Hai-tao4

(1. The Affiliated Changsha Hospital of Hunan Normal University, Changsha 410006, China; 2. Department of Gastroenterology, Fouth Hospital of Changsha, Changsha 410006, China; 3. Department of oncology, Xiangtan Central Hospital, Xiangtan 411100, China; 4. The Affiliated Changsha Hospital of Hunan Normal University, 410006, China)

ObjectiveTo investigate the mechanism of HepG2 tumor vaccine transfected hGM-CSF gene mediated by HA nanoparticles on inducing HepG2 cells epithelial-mesenchymal transition through interleukin-6(IL-6).MethodsHepG2 cells transfected with GM-CSF Gene after60Co irradiation vaccine were co-cultured with IL-6 stimulated HepG2 cells in vitro. The vaccine group and other group cells migration and invasion were detected by transwell chamber assays； the expression of E-cadherin, p-Stat3, Twist proteins was evaluated by Western blot； the expressions of EMT-associated genes: E-cadherin, Twist in HepG2 cells were analyzed with real-time fluorescence quantitative (q RT-PCR).Results①By pretreatment with IL-6, the ability of cell migration and invasion was significantly increased； IL-6 group cells passing through the reconstituted basement membrane higher than negative control group. ②The expression level of E-cadherin in IL-6 group was lower than that in negative control group, the expression of Twist and p-Stat3 protein was increased. ③Vaccine group cells passing through the reconstituted basement membrane less than other three groups. ④vaccine group than the other three groups of E-cadherin protein expression increased, whereas the expression of p-STAT3 and twist proteins decreased . ⑤In Vaccine group the expression of E-cadherin mRNA up-regulated compared with other groups, while Twist mRNA down-regulated.Conclusion①IL-6 has the ability to induce HepG2 cells to produce EMT. ②HepG2 cells transfected with GM-CSF Gene after60Co irradiation vaccine may reverse IL-6 induced HepG2 cell EMT by down-regulated the expression of transcription factor Twist and Stat3.

hepatoma carcinoma； GM-CSF gene； epithelial-mesenchymal transition； tumor vaccine； IL-6

R73-36+2；R735.7

A

1673-016X（2016）06-0004-04

2016-08-28

湖南省衛生廳科研基金資助項目（NO.2005-178）

段曉明，E-mail：xiaomingduan@21cn.com