產D-海因酶微生物的篩選及其催化特性

李 磊， 許國超， 韓瑞枝， 倪 曄*

（1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

產D-海因酶微生物的篩選及其催化特性

李 磊1，2， 許國超1，2， 韓瑞枝1，2， 倪 曄*1，2

（1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

為獲得高活性和立體選擇性海因酶生產菌株，首先采用氨基酸關環法合成了數種5'-單取代海因衍生物及N-氨甲酰-氨基酸，建立了相關液相色譜檢測方法。然后以實驗室保藏的野生菌株出發，利用底物誘導的方法篩選到6株具有D-海因酶活性的野生菌，其中熒光假單胞菌產生的D-海因酶具有較好的底物譜，較高的活性和立體選擇性。經優化后，其最適產酶溫度為30℃，培養時間為12 h，發酵活力達到92.1 U/L。該菌催化D-海因水解的最適反應溫度為60℃，pH 8.5。在50 mL體系中，利用0.25 g菌體（干重）可對映選擇性水解20 mmol/L對羥基苯海因底物，反應3 h轉化率達到98%。

D-海因酶；D-氨基酸；熒光假單胞菌；5'-單取代海因

D-氨基酸是一類重要的非天然氨基酸，廣泛分布在自然界中，如細菌細胞壁的肽聚糖[1]，抗菌肽[2]。此外，動物體內也存在游離態D-氨基酸，且具有一定的生理功能，如老鼠大腦中含有D-絲氨酸[3]。D-氨基酸及其衍生物是醫藥、農藥、和食品等精細化工中的重要原料，例如：D-對羥基苯甘氨酸是β-內酰胺類抗生素的重要手性中間體，D-纈氨酸可應用于合成殺蟲劑，而D-丙氨酸是生產人造甜味劑—阿斯巴甜的重要原料[4]。鑒于D-氨基酸的重要作用，目前已有報道采用化學法、發酵法以及海因酶/氨甲酰酶、己內酰胺酶、酯酶、氨基轉移酶、酮酸脫氫酶等酶催化方法用于D-氨基酸的合成，而海因酶法也是用于制備光學純手性氨基酸最高效和廣泛應用的方法之一。

D-海因酶（D-hydantoinase，EC3.5.2.2），又稱乙內酰脲酶，多數為金屬離子依賴酶，一般為同源二聚體或四聚體，廣泛分布在微生物、動物和植物中[5-6]，見圖1。它可以催化海因及5′-單取代海因中內酰胺鍵開環生成N-氨甲酰氨基酸，再經去氨甲酰作用得到相應的D-氨基酸。近年來，國內市場對D-氨基酸，尤其是生產β-內酰胺類抗生素所需的D-對羥基氨基苯甘氨酸和D-苯甘氨酸需求量很大，而目前主要依賴進口。由于發酵法或微生物轉化法具有周期短、效率高、成本低等優點備受關注。通過篩選具有高對映選擇性和催化活性的D-海因酶產生菌株，構建用于D-氨基酸生產的高效生物轉化體系意義深遠。已有文獻報道農桿菌、假單胞菌、節桿菌和芽孢桿菌等菌屬[7-8]的微生物可以產生D-海因酶。

化學法合成5′-單取代海因衍生物的方法有多種，常用的有Suzuki法、縮合加氫法和氨基酸關環法[9]。雖然氨基酸關環法以氨基酸為初始底物，生產成本較高，然而其具有操作簡單、反應物無毒、產物易分離、收率高等優點，目前仍然是高效合成5′-單取代海因衍生物方法之一。

圖1 微生物催化海因底物的對映選擇性水解Fig.1 Enantioselective resolution of D，L-hydantoin into N-carbamyl-D-amino acid catalyzed by microorganism

作者利用氨基酸關環法合成了數種海因衍生物及其中間物質N-氨甲酰氨基酸，然后以對羥基苯海因和異丁基海因不對稱拆分反應為靶向反應，對作者所在實驗室保存的23株野生菌進行酶活篩選，以期得到高對映選擇性和催化活性的D-海因酶生產菌。最終成功篩選到6株可水解5′-單取代海因底物的野生菌株，其中熒光假單胞菌表現出最高的催化活性和對映選擇性，并對其發酵產酶及催化反應條件進行了優化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 作者所在實驗室保存的23株野生菌。

1.1.2 培養基及溶液

1）Luria-Bertani（LB）培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，pH 7.2，固體培養基加入2 g/dL瓊脂。

2）營養肉湯（NB）培養基：蛋白胨10 g/L，牛肉粉3 g/L，氯化鈉5 g/L，pH 7.2，固體培養基加入2 g/dL瓊脂。

3）底物誘導溶液：異丁基海因母液（100 mmol/L異丁基海因，溶于pH 8.5、100 mmol/L磷酸鹽緩沖液）；對羥基海因母液（100 mmol/L對羥基苯海因的乙醇懸濁液）。

4）底物轉化反應體系I：20 mmol/L異丁基海因，溶于pH 8.5、100 mmol/L磷酸鹽緩沖液。

5）底物轉化反應體系II：10 mmol/L對羥基苯海因，溶于pH 8.5、100 mmol/L磷酸鹽緩沖液。

1.1.3 主要儀器 日立Chromaster高效液相色譜儀；Waters sunfireTMC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；安捷倫1200高效液相色譜儀；Waters Xbridge C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；大賽璐CHARALCEL○ROD-H色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；Thermo-TSQ QUANTUM ULTRA質譜儀；Thermo SCIENTIFIC Hypersil GOLD column（250mm×4.6 mm，5 μm）；AVANCE III 400 MHz全數字化核磁共振譜儀。

1.1.4 5’-單取代海因底物 對羥基苯海因（≥98%）：上海嵐克醫藥科技發展有限公司；異丁基海因，異丙基海因，苯甲基海因，吲哚甲基海因，鄰氯苯海因：均為作者所在實驗室合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 氨基酸關環法合成5’-單取代海因[10-11]按摩爾比1.5～1.75∶1稱取NaCNO及氨基酸（D/L-Val，D/L-Ile，D/L-Phe，D/L-Trp，D/L-鄰氯苯甘氨酸，LVal，L-Trp）至250 mL圓底燒瓶，按每克氨基酸添加15～20 mL去離子水溶解以上化合物，于80℃油浴中攪拌反應2 h。待冷卻至60℃后，加入濃鹽酸調pH至2～3，此時溶液由澄清立即變為懸濁液。等懸濁液冷卻至室溫，抽濾，并用去離子水洗滌，將固體在50℃恒溫箱中烘干，此時獲得的物質為N-氨甲酰氨基酸。同時將濾液和洗滌液的N-氨甲酰氨基酸收集，于60℃減壓蒸餾將液體蒸發至有固體析出，冷卻、抽濾、洗滌、烘干。

取N-氨甲酰氨基酸加入到250 mL燒瓶中，按每克N-氨甲酰氨基酸加入15～20 mL蒸餾水，每摩爾反應物加入2 mol濃硫酸，于105℃油浴條件下攪拌反應3 h。反應結束后于4℃冷卻結晶，將固體抽濾并用去離子水洗滌。為進一步獲得純度較高的5′-單取代海因，將所得固體再加入適量去離子水加熱溶解后抽濾，濾液于4℃結晶，再經抽濾、烘干即為5′-單取代海因。因濾液中仍有少量產物，將每次抽濾后的液體旋轉減壓蒸餾再次結晶。

取10 mg左右的合成產物加入到干凈的離心管中，加入1mL氘帶二甲基亞砜振蕩溶解，取適量轉移至核磁管中。用AVANCE III 400MHz全數字化核磁共振譜儀分析鑒定。

1.2.2 5’-單取代海因、N-氨甲酰氨基酸及D-氨基酸的分析方法

1）D-海因酶活性檢測：取100 μL反應液加入等體積顯色劑（10%對二甲氨基苯甲醛（PDAB），溶于6 mol/L鹽酸）進行顏色反應，出現黃色的菌株為陽性菌株。

2）反相HPLC：采用配有Waters SunfireTMC18色譜柱的Chromaster高效液相色譜儀分析海因及N-氨甲酰氨基酸，流動相中甲醇比例如表1所示。流速為1 mL/min，柱溫30℃，檢測波長為210 nm，保留時間見表2。

3）正相手性HPLC：采用OD-H色譜柱分析外消旋的N-氨甲酰氨基酸，流動相為異丙醇∶正己烷∶三氟乙酸=15∶85∶0.1，流速0.8 mL/min，柱溫30℃，檢測波長UV210 nm。

4）氨基酸檢測：準確稱取50 mg鄰苯二甲醛（OPA），溶解于4.5 mL甲醇中，加入50 μL β-巰基乙醇，500 μL 0.1 mmol/L四硼酸鈉，混勻后即得OPA衍生化試劑，于-4℃保存備用。按2 μL樣品、5 μL 0.1 mmol/L四硼酸鈉，3 μL OPA衍生化試劑的比例進行柱前衍生化，采用Xbridge C18色譜柱進行分析，柱溫為30℃，流速1 mL/min，檢測器波長為UV338 nm。

5）LC-MS：采用 Hypersil GOLD column（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動相為20%~35%甲醇梯度洗脫10 min，流速0.2 mL/min，進入Thermo-TSQ QUANTUM ULTRA質譜儀，在負離子模式檢測。

1.2.3 酶活測定 取5 mL菌液離心獲得菌體，向菌體中加入1 mL底物轉化溶液，在90 r/min、37℃下反應10 min后加入1 mL 10%三氯乙酸終止反應，12 000 r/min離心10 min，上清液經0.22 μm濾膜過濾后，用反相HPLC法檢測。酶活力定義：1 min內催化底物生成1 μmol N-氨甲酰氨基酸所需的菌體量為一個活力單位（U）。

1.2.4 立體選擇性分析 取等體積10%三氯乙酸溶液加入到菌體轉化液中，靜置30 min，12 000 r/min離心10 min除去細胞，取出上清液加入到50 mL圓底燒瓶中，低壓狀態下經旋轉蒸發裝置去除液體，固體于50℃干燥除去殘留水分，加入異丙醇溶解，于12 000 r/min離心10 min，經0.22 μm濾膜過濾后，取10 μL樣品采用正相手性HPLC法進行立體選擇性分析。

1.2.5 N-氨甲酰氨基酸酰胺水解酶活性驗證 以分析反應體系中是否有D-氨基酸的生成為指標，檢測菌株是否含有N-氨甲酰氨基酸酰胺水解酶的活性。從反應體系中取樣，經0.22 μm濾膜過濾后，按上述氨基酸檢測方法分析是否有氨基酸生成。

2 結果與分析

2.1 5’-單取代海因的合成

氨基酸關環法合成5′-單取代海因共分兩步，首先α-氨基酸與氰酸鈉于80℃反應生成N-氨甲酰氨基酸，第二步N-氨甲酰氨基酸在酸性條件下于105℃分子內失去一分子水縮合生成5′-單取代海因。另外在合成過程中，具有還原性的氨基酸很容易被氧化，曾嘗試通過對羥基苯甘氨酸合成相應的海因物質，最終檢測發現合成的物質不是目標物質，經分析鑒定發現與苯環相連的羥基被氧化。所有產物經1H-NMR驗證，與目標物質相符。

反應過程中，為提高氨基酸的轉化率，將氨基酸與氰酸鈉的摩爾比控制為1∶1.5～1.7。反應2 h，轉化率可達到97%以上。由于中間物N-氨甲酰氨基酸在酸性環境下的溶解度很低，加入濃鹽酸調pH至2～3后即產生白色沉淀N-氨甲酰氨基酸。而此時氰酸鉀的溶解度很高，通過簡單的抽濾分離可獲得純度較高的N-氨甲酰氨基酸。最終N-氨甲酰氨基酸純度大于98%，摩爾回收率可達97%。

提純后的N-氨甲酰氨基酸在高溫條件下經硫酸的催化作用，分子內縮合失去一分子水得到最終產物5′-單取代海因。為提高產物收率和后期分離效率，將反應時間延長到3 h，中間物的轉化率大大提高，最終產物的摩爾收率均為94%以上。海因衍生物在高溫下溶解度較高，而溫度降低時物質在中性環境下的溶解度下降顯著。在分離純化過程中，采用了固體加熱溶解再結晶的方法。反應結束后液體冷卻，將固體經抽濾分離后，加入一定量的去離子水，經加熱溶解過濾后濾液在4℃重結晶即得純品。經純化后產物的純度能夠達到98%以上。不同5′-單取代海因的合成效率見表1。

表1 不同5’-單取代海因的合成效率Table 1 Synthetic yield of various 5’-monosubstituted hydantoins

2.2 底物及中間物質的液相色譜檢測條件

由于5'-單取代海及相應的N-氨甲酰氨基酸均為水溶性且具有紫外吸收，因此采用反相HPLC進行分析。選用Waters SunfireTMC18色譜柱，流動相組成見表2。以確保海因衍生物與其對應的N-氨甲酰氨基酸的分離度R＞1.5，各物質的保留時間見表2。

表2 5’-單取代海因及其水解產物N-氨甲酰氨基酸的色譜分析條件Table 2 HPLC analysis of 5’-monosubstituted-hydantoins and corresponding N-carbomyl-amino acids

2.3 D-海因酶活性菌株的篩選

常用的海因酶產生菌篩選方法有3種[12-13]：一是利用海因衍生物為惟一氮源或碳源法，二是雙層平板法，三是微孔板篩選法。但是此3種方法均具有一定的局限性，第一種策略由于營養苛刻，因而易漏篩，第二、三種方法易受菌株本身產生的顏色和副產物影響。作者選擇了搖瓶培養法，即：培養基中加入適量的酵母膏和胰蛋白胨等營養物質，為菌體的生長提供保障；同時在培養過程中加入底物對其誘導產酶，培養結束后將離心洗滌后的菌體用于底物轉化。由于產物N-氨甲酰氨基酸可以與顯色劑4-二甲氨基苯甲醛（Ehrlich’s reagent）在酸性條件下反應生成黃色物質，可用于檢測陽性菌株，反應原理見圖2。

在選擇誘導劑時，考慮到不同菌株來源的海因酶底物譜范圍和最適底物不同，因而選擇了烴鏈衍生族的異丁基海因和芳香族的對羥基苯海因分別作為誘導劑誘導細胞表達海因酶。經過活性檢測得到6株陽性菌株分別為：熒光假單胞菌CGMCC1.1802，洋蔥伯克霍爾德CGMCC1.1813，惡臭假單胞菌901，惡臭假單胞菌KT2440，銅綠假單胞菌1-3，土壤農桿菌F1。

圖2 D-海因酶活性篩選的顏色反應原理Fig.2 Mechanism of chromogenic reaction in screening of D-hydantoinase activity

為了考察6株活性菌株是否具有進一步將N-氨甲酰氨基酸水解為氨基酸的N-氨甲酰水解酶活性，利用液相柱前鄰苯二甲醛（OPA）衍生法測定是否有氨基酸生成。樣品經HPLC分析后得到的色譜圖與標樣比較，所有樣品在相應的保留時間處沒有產生特征峰，即所篩選的菌株中不含有N-氨甲酰氨基酸酰胺水解酶。

利用LC-MS對陽性菌株的催化產物進行分析，以驗證其催化海因水解后產物為N-氨甲酰氨基酸。首先，用菌體催化異丁基海因，轉化液經離心過濾后，進入超高效液相分離后經質譜檢測，在負離子狀態下測定分子及其碎片大小，因為無機鹽對質譜儀的損害較大，所以從第2分鐘開始檢測。6株菌的測定結果顯示，產物均為相應的N-氨甲酰氨基酸。圖3為熒光假單胞菌CGMCC1.1802轉化產物的LC-MS圖譜。異丁基海因經D-海因酶轉化為N-氨甲?；?異亮氨酸，相對分子質量由156變為174.1?？梢钥吹较鄬Ψ肿淤|量175.10為帶一個H＋的N-氨甲?；?異亮氨酸，而196.87的峰為產物帶一個Na＋，均可以證明產物為N-氨甲酰異亮氨酸。

圖3 熒光假單胞菌轉化液的LC-MS圖Fig.3 LC-MS result of Pseudomonas fluorescens CGMCC1.1802 catalyzed reaction

對篩選到的海因酶陽性菌株進一步誘導培養，分別測定利用所得菌體對烴基海因 （20 mmol/L異丁基海因）和芳香族海因（10 mmol/L對羥基海因）的初速度及選擇性，見表3。結果顯示：惡臭假單胞菌KT2440對對羥基苯海因和異丁基海因的酶活分別為8.43 U/L和53.9 U/L，且催化產生D-型產物，產物的ee值分別為98.2%和97.9%；土壤農桿菌F1對異丁基海因的酶活力為23.5 U/L，對羥基苯海因的酶活力僅為8.00 U/L，產物的立體選擇性均低于96%；而熒光假單胞菌CGMCC1.1802對異丁基海因和對羥基苯海因的酶活分別為23.4 U/L和20.4 U/ L，立體選擇性均大于98%，對兩種類型底物均表現出很好的催化性能，尤其是對于芳香族海因類底物。因此，對熒光假單胞菌產D-海因酶的條件及反應體系進行了進一步優化。

2.4 熒光假單胞菌產D-海因酶發酵條件優化

為獲得更高的酶產量以滿足催化反應的需要，對熒光假單胞菌的誘導產酶條件進行了研究。首先考察了誘導時間的影響，將種子液以2%的接種體積分數轉接于新鮮的LB培養基中，加入終濃度為2 mmol/L異丁基海因，于30℃誘導培養，間隔一定時間取樣測定酶活力及OD600。發現在12 h時酶活達到最大值，約為92.1 U/L。由圖4可知，在培養前期，酶產量與菌濃平行增長；當菌體生長進入穩定期后，OD600不再繼續增加，而酶活力下降嚴重。此海因酶為胞內組成型表達酶，隨菌體的增多而增加，當菌體進入穩定期后，培養基中的營養消耗殆盡，細胞老化，胞內的氧化性自由基增多，使海因酶氧化失活。

表3 陽性菌株對海因底物的催化活力及立體選擇性Table 3 Enzymatic activity and enantioselectivity of hydantoin resolution catalyzed by selected strains

圖4 熒光假單胞菌菌體生長和產酶曲線Fig.4 Time course of cell growth and D-hydantoinase production of P.fluorescens

對菌株誘導產酶的溫度進行了考察，同樣按2%的接種體積分數將種子液轉接于新鮮的LB培養基中，分別于25、30、35、37℃下誘導培養12 h后測定菌體酶活。在30℃下培養的菌體具有最高的酶活，對異丁基海因底物的活力為92.1 U/L，見圖5。該溫度與菌體生長的最適溫度一致，在最適生長溫度下有利于細胞增殖和蛋白質的正常合成，因此在此溫度下表現出最高酶活力。

基于以上對熒光假單胞菌產酶和催化條件的優化，將該菌株于30℃誘導培養12 h（OD600約為7.5），測得其對20 mmol/L的不同海因底物（包括：異丁基海因、異丙基海因和對羥基苯海因）的單位發酵液酶活力分別為92.1、82.4、85.3 U/L。

圖5 溫度對熒光假單胞菌產D-海因酶的影響Fig.5 Influence of induction temperature on D-hydantoinase production of P.fluorescens

2.5 熒光假單胞菌D-海因酶的性質研究

利用上述發酵制備的D-海因酶產生菌體，對羥基苯海因作為模型底物，對其酶學性質進行了研究?？疾炝怂鼈冊诓煌琾H下海因酶酶活力高低的變化。數據顯示，酶活隨pH的升高先增加后降低，最適pH偏堿性，為8.5左右（圖6a）。同時研究了在不同溫度下保溫30 min后酶活的變化，結果顯示該酶催化反應的最適溫度為60℃（圖6b）。海因衍生物在堿性和高溫條件下，溶解度升高，外消旋速率加快，有利于加速反應進程，達到更高的轉化率和收率[14]。然而當溫度超過50℃時，底物易分解變質。因此在接下來的選擇性水解海因制備D-氨甲酰氨基酸的反應中采用pH 8.5和50℃的最適催化條件。

為了更好探究該D-海因酶產生菌的催化潛力以有助于指導在D-氨甲酰氨基酸合成中的應用，對其底物特異性進行了進一步考察。分別測定了熒光假單胞菌菌體對不同5′-單取代海因底物（10 mmol/L，溶于磷酸鈉緩沖液（pH 8.5，100 mmol/L））水解反應的初速度，結果見表4?？梢钥闯?，此海因酶對異丙基海因、異丁基海因和對羥基苯海因具有很高的催化活力，而對疏水性較強和側鏈較大的芐基海因、鄰氯苯海因和吲哚甲基海因催化活性較低，相對酶活＜10%，由于這些底物的側鏈具有較大的苯基、芐基等，空間位阻較大，不利于底物進入活性口袋。對映選擇性分析發現，與側鏈較小的異丙基海因相比，該酶對側鏈較大的對羥基苯海因和異丁基海因具有更好的立體選擇性，原因可能是D-海因酶的催化口袋與異丙基海因的側鏈不完全匹配[15]。

圖6 不同pH和溫度對熒光假單胞菌海因酶酶活的影響Fig.6 Effect of pH and temperature on enzymatic activity of D-hydantoinase produced by Pseudomonas fluorescens

100 mL菌液離心可得約0.25 g細胞（干重），以其為催化劑考察在海因衍生物水解反應中的效果。分別加入50 mL、100 mmol/L異丁基海因和50 mL、20 mmol/L對羥基苯海因，于50°C轉化，定時取樣，向樣品中加入等體積的10%三氯乙酸以終止反應，利用反相HPLC測定產物含量并計算轉化率。菌體在催化異丁基海因時，反應4 h后轉化率為36%，6 h后轉化率達到49.3%，并保持不變。這是由于異丁基海因在溶液中自身的消旋能力非常弱，外消旋異丁基海因底物不能被完全轉化，只有D-異丁基海因被水解，因此最大轉化率僅為50%。在催化對羥基苯海因時，由于其溶解度較低，所以選擇了20 mmol/L底物濃度，反應1 h轉化率達到40%，3 h時轉化率達到98%。這是由于對羥基苯海因可以通過烯醇互變異構體由L-構型轉變為D-構型[14]，從而實現自發消旋，因此外消旋對羥基苯海因的最大轉化率可達到100%。

表4 D-海因酶對不同5′-單取代海因底物的催化活性Table 4 Substrate specificity of D-hydantoinase from Pseudomonas fluorescens

3 結語

D-海因酶是生產D-氨基酸的重要酶制劑，已被應用于生產D-對羥基苯甘氨酸和D-苯甘氨酸。從作者所在實驗室保藏的微生物出發，篩選到6株具有D-海因酶活性的菌株。其中，熒光假單胞菌來源的D-海因酶具有較寬的底物譜，該D-海因酶對短側鏈的異丁基海因和異丙基海因以及芳香基團的對羥基苯海因的催化活力較高，單位發酵液酶活分別為92.1、82.4、85.3 U/L，對映選擇性（ee）分別為98.7%，97.5%和98.8%。該菌株催化反應的最適pH為8.5，最適溫度為60℃。在該反應條件有利于提高底物的溶解度和外消旋速率，進而增加酶的催化速率和產物收率。與同類文獻報道相比[16]，本研究的D-海因產生菌熒光假單胞菌具有優越的催化性能，對其中的D-海因酶進行異源高表達后在不對稱水解海因制備D-氨基酸方面將會具有更大的潛力。

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Screening of D-Hydantoinase-Producing Microorganism and Its Catalytic Properties

LI Lei1，2， XU Guochao1，2， HAN Ruizhi1，2， NI Ye*1，2
（1.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Hydantoinases are important enzymes with industrial potential in producing D-amino acids.In this study，6 strains with hydantoinase activity were selected from 23 wildtype microbial strains using 5'-monosubstituted hydantoin derivatives as induce substrates.Four 5'-monosubstituted hydantoins were chemically synthesized and verified with 1H-NMR.From 6 hydantoinase-producing strains，strain Pseudomonas fluorescenswas successfully identified with the highest enantioselectivity，desired substrate specificity and high activity in the hydrolysis of 5'-monosubstituted hydantoins andwas selected for further study.After induction with hydantoin substrates at 30℃for 12 h，the D-hydantoinase activity could reach 92.1 U/L.The reaction condition was optimized to be 60℃and pH 8.5，which was in favor of the spontaneous racemization of substrate.In a 50 mL whole-cell biocatalytic system，20 mmol/L D，L-p-hydroxyphenyl hydantoin was enantioselectively hydrolyzed by 0.25 g dry cells with a conversion ratioof 98%within 3 hours.

D-hydantoinase，D-amino acid，Pseudomonas fluorescens，5'-monosubstituted hydantoin

Q 93

A

1673—1689（2016）12—1292—08

2014-11-22

國家自然科學基金項目（21276112）；國家973計劃項目（2011CB710800）；教育部新世紀優秀人才計劃項目（NCET-11-0658）。

*通信作者：倪 曄（1975—），女，江蘇無錫人，理學博士，教授，博士研究生導師，主要從事生物催化和酶工程方面的研究。E-mail：yni@jiangnan.edu.cn