RNA干擾在腫瘤治療中的靶點研究

袁慎俊，陳濤

(三峽大學醫學院，湖北宜昌443002)

RNA干擾在腫瘤治療中的靶點研究

袁慎俊，陳濤

(三峽大學醫學院，湖北宜昌443002)

RNA干擾是一種轉錄后基因沉默機制。通過RNA干擾技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，進而為惡性腫瘤的治療提供一種嶄新的手段。本文就RNA干擾的機制、作用靶標及相關的臨床應用做一綜述。

RNA干擾；基因沉默；微小RNAs；長非編碼RNAs；腫瘤治療

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是生物進化過程中遺留下來的一種在轉錄后通過小RNA分子調控基因表達的現象[1]。其靶點特異性比小分子藥物更高，且不需要特殊的結合蛋白，可以直接作用于單克隆抗體無法到達的靶點，直接阻止某些基因翻譯產生致病蛋白，在源頭阻斷疾病發生，從而避免了使用小分子藥物或其他生物制劑在分子級聯通路下游治療疾病。腫瘤的發生是多個基因相互調控作用“失靈”的結果，當前對腫瘤的治療主要是通過物理和化學的方法抑制DAN復制及細胞增殖，進而殺死癌細胞，然而這些方法不可能完全抑制或逆轉腫瘤的生長。而RNA干擾可以利用同一基因家族中多個成員具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設計針對這一序列的dsRNA分子，只導入一種dsRNA即可以使多個基因同時沉默，從而促使癌細胞生長停滯。

1 siRNA與RNA干擾

RNA干擾是一種基因轉錄后沉默機制，它由雙鏈RNA(Doublestranded RNA，dsRNA)啟動，在Dicer酶的參與下，把RNA分子切割為小分子干擾RNA(Small interfering RNA/shortinterfering RNA，siRNA)，并特異性地與mRNA的同源序列結合，從而產生相應的功能表型缺失的現象。RNA干擾技術實質是將siRNA通過不同方式導入到細胞或動物體內，將相應的目的基因沉默掉，進而使相應的功能表型缺失。在動植物體中，轉錄后基因沉默是通過dsRNA介導的，dsRNA在序列上與靶基因具有同源性。RNA干擾能夠高效沉默具有調節特殊生理/病理通路功能的靶基因，并且能夠在轉錄水平上通過siRNA下調靶mRNA[2]。有研究表明，人類疾病相關基因的過度表達將成為基于RNA干擾治療的一個潛在靶點[3]。由于RNA干擾的高度特異性和低毒性，該技術已經成為基因功能和基因治療方面的有效工具，并且可以治療傳統藥物無法治愈的各種人類疾病，比如高膽固醇血癥[4]、病毒性肝炎[5]、亨廷頓氏舞蹈癥[6]。

在惡性腫瘤中，RNA干擾可以沉默由基因擴增、突變或者過表達而引發的癌基因。研究顯示，在腫瘤治療中，RNA干擾在細胞凋亡、自噬、腫瘤代謝和細胞衰老等方面取得了巨大成功[7]。目前，應用基于RNA干擾的基因沉默來治療腫瘤已經有了實質性進展，并且正在進行中的藥物臨床試驗有望替代傳統的腫瘤化療。

2 miRNAs作為RNA干擾的靶標

MicroRNA(miRNA)是一種小的內源性非編碼RNA分子，由21～25個核苷酸組成。這些小的miRNAs通常靶向一個或者多個mRNAs，通過翻譯水平的抑制或斷裂靶標mRNAs而調節基因的表達。最近有研究表明，miRNAs與癌癥有確切聯系，它們在腫瘤發生中扮演著癌基因或者抑癌基因的角色。進一步的證據表明，miRNAs在腫瘤進展方面也起著重要作用，包括腫瘤血管生成[8]、轉移[9-10]以及對干預治療的反應性[11]。因此，鑒別具有致癌作用的miRNAs對腫瘤治療有著深遠影響。有報道顯示抑制參與致癌作用的miRNAs可以阻斷許多癌癥相關的信號通路，如miR-21。Tomimaru等[12]證明轉染了抗miR-21的肝癌細胞對IFN-α/5-Fu的化療更加敏感了，而且在臨床患者的肝癌標本中，miR-21的表達高低與患者對IFN-α/ 5-Fu聯合治療的反應性和生存率有關。又如，全身給予肝癌移植瘤小鼠具有抗miR-221同工修飾的膽固醇或者抗miR-221的寡核苷酸可以增加小鼠的生存周期和顯著減少腫瘤結節的數目及大小[13-14]。在子宮內膜癌中，miR-let-7是下調的，并且Let-7 miRNAs與子宮內膜癌的發生高度相關。一項調查顯示Let-7a在提升癌細胞的增殖方面能對抗Aurora-B的功能，并且是通過下調Aurora-B蛋白水平介導的[15]。Zhang等[16]證明miR-125b能通過調節抑癌基因Bak1的表達來促進急性早幼粒細胞白血病細胞的增殖和抑制細胞凋亡。miR-155的過量表達能夠減少SMAD5的表達和誘導TGF-β對淋巴瘤的生長抑制[17]。Zhang等[18]構建質粒pSUPER-c-FLIP-siRNA并將其轉染U2OS細胞，發現由于c-FLIP-siRNA的干擾細胞FLICE抑制蛋白(c-FLIP)的表達明顯受到抑制。

除了miRNAs的多靶點受到調節外，其本身也可以受到體內其他因子的影響。例如轉錄因子E2F1可以通過激活miR-17-92的表達來促進各種腫瘤進展。反過來miR-17-92也可以通過調控E2F的平衡使促凋亡的E2F1表達和促增殖的E2F3表達[19]。Egger等[20]一項新發現表明，表觀遺傳變異比如DNA甲基化和組蛋白修飾，能夠影響miRNAs的表達。例如，在5-Aza-CdR(一種DNA甲基化抑制劑)和苯基丁酸(一種組蛋白去乙酰酶抑制劑)治療的腫瘤中，miR-127在腫瘤細胞中顯著上調。Scott等用組蛋白去乙?；?Histone deacetylase，HDAC)抑制劑LAQ824處理乳腺癌細胞SKBr3，其miRNAs的轉錄受到明顯抑制[21]。這些發現表明多種致癌性miRNAs和表觀遺傳學藥物可以作為RNA干擾腫瘤治療的潛在靶點。

3 lncRNAs作為RNA干擾的靶標

長非編碼RNAs(Long noncoding RNAs，lncRNAs)是一組內源性、長度大于200個核苷酸、特異完整的開放閱讀框和無蛋白質編碼功能的RNA[22]。參與了一些生物過程如表觀遺傳調控[23-24]、細胞凋亡和細胞周期調控[25]、細胞發育和分化[26]、基因轉錄調節[22]。研究表明，在人類癌癥中lncRNAs的失調是一個重要特征。最近，多種lncRNAs被認為在癌癥的發生發展中扮演著關鍵作用[27-28]。因此，可以預見致癌性lncRNAs可用于癌癥的診斷和預后判斷，并且可以作為腫瘤治療的潛在靶點。目前，最常用的方法是利用RNA干擾來調節癌細胞的lncRNAs水平或功能。

肺腺癌轉移相關轉錄子1(MALAT1)是一個長度大約8 000個核苷酸和位于染色體11q13上的核lncRNA，與腫瘤的轉移和復發相關[29-30]。MALAT1能誘發各種腫瘤細胞的惡性潛能，并且這種作用可以通過抑制MALAT1得以逆轉。在肺腺癌中，通過RNA干擾使MALAT1沉默來下調運動相關基因的表達從而破壞細胞的運動能力[31]。下調MALAT1也可以影響EMT相關基因的表達，從而減少ZEB1、ZEB2和Slug的水平，增加E鈣黏附素的水平[30，32]。此外，低表達MALAT1的非小細胞肺癌細胞接種裸鼠可以影響腫瘤的形成和生長，并且高表達MALAT1的肺鱗癌預后不良[32]。

另一個屬于lncRNAs子類的是HOX基因轉錄反義RNA(HOTAIR)，它是第一個與轉移相關的lncRNAs。有臨床研究顯示：HOTAIR表達水平與多種腫瘤(如乳腺癌、結直腸癌、肝癌、胰腺癌、喉癌等)的發生發展及轉移預后密切相關。高表達HOTAIR能抑制抑癌基因的表達，促進腫瘤復發轉移，而下調HOTAIR表達則降低腫瘤細胞的轉移侵襲能力[33-34]。這些預示HOTAIR在癌癥生物學中扮演著極其重要的角色和顯示出了重要的臨床意義。HOTAIR參與了多樣生物過程造成的惡性表型，并且這種改變可以通過抑制HOTAIR得以逆轉。乳腺癌中HOTAIR的高表達能夠抑制細胞增殖和侵襲[35]。在癌細胞中HOTAIR能夠通過抑制MMP-9和VEGF蛋白表達來減少細胞的運動和轉移[36]。HOTAIR低表達的胰腺癌細胞在小鼠異種移植瘤模型中能夠抑制腫瘤生長[33]?？傊?，大量的研究正在進一步明確lncRNAs的分子功能，基于RNA干擾lncRNAs的腫瘤治療可能成為一種新的治療方法。

4 RNA干擾的臨床試驗

基于RNA干擾的腫瘤治療已經成為了一項新技術，正在以前所未有的速度應用到臨床中。第一個基于RNA干擾的抗腫瘤藥物CALAA-01(CALAA-01為RONDELTM注射配方與瞄準癌癥治療的siRNA序列)，它是一類由環糊精分子包裹而成的納米顆粒，可以在實體瘤中累積，阻止其靶點RRM2(RRM2是核糖核酸酶的M2亞基，在細胞分裂過程中起重要作用)的翻譯，從而抑制癌細胞分裂。靜脈給藥CALAA-01對肝癌、黑色素瘤和尤因肉瘤異種移植瘤小鼠有顯著抗腫瘤效果，并且在非人靈長類動物中沒有觀察到肝毒性和免疫反應[37]。

由美國奧尼蘭姆(Alnylam)生物技術公司開發的ALN-VSP02，借用脂質納米顆粒包被兩種針對VEGF和紡錘體驅動蛋白的siRNAs，通過沉默與腫瘤組織血管生成相關的生長因子的蛋白合成，來抑制腫瘤區血管的生成，達到將癌細胞“餓死”的效果。人體試驗表明全身性遞送siRNA能夠減少腫瘤的肝內轉移和增強肝癌化療的敏感性，并且采用兩周一次的靜脈給藥ALN-VSP是安全的和耐受性良好[38]。siRNA的脂質體復合物Atu027能夠靶向蛋白激酶N3，全身給藥時，能夠顯著抑制腫瘤生長及淋巴結或肺的轉移，并且沒有劑量依賴性毒性[39-40]。由穩定核酸脂質顆粒(SNALPs)制備的polo樣激酶I(PLK1)[41]或VEGF的siRNA已經被開發用來評估基于RNA干擾治療原發性肝癌或肝轉移癌患者的安全性和有效性。這些臨床試驗表明，RNA干擾的發現不僅為抗癌藥物的開發提供了快速和嶄新的方法，而且也有可能成為治療癌癥的下一個新手段。

5 展望

RNA干擾技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的治療。對于癌癥來說，RNA干擾或許可以成為一個強有力的武器，尤其是對于目前還沒有靶向藥物的致癌基因。以MYC為例，該基因同很多種癌癥發生有關，但是目前還沒有對抗這個基因的有效藥物，RNA干擾則給研究者提供了一個有力工具，它不像小分子藥物和生物制劑通過抑制突變蛋白來控制癌癥，而是直接阻斷蛋白產生過程。隨著RNA干擾技術的不斷研究深入及基礎研究向臨床應用的轉化，相信在不久的將來，RNA干擾將成為腫瘤治療的又一新手段。

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Application of RNA interference in cancer therapy.

YUAN Shen-jun,CHEN Tao.Medical College of Three Gorges University,Yichang 443002,Hubei,CHINA

RNA interference(RNAi)is a post-transcriptional gene silencing.With RNAi technique,we can specially reject or shut off the expression of certain genes and thereby provide a new therapy for maligant tumors.In this paper,the mechanism of RNAi,the target and related clinical applications are reviewed.

RNAi;Gene silencing;miRNAs;lncRNAs;Cancer therapy

R730.5

A

1003—6350（2016）01—0085—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.01.030

2015-05-07)

國家自然科學基金(編號:81173612)

陳濤。E-mail：chentao@ctgu.edu.cn