腸道病毒71型與臨床手足口病關系的研究進展*

張　勝，王　楊△，李凌佳 綜述，高　輝 審校

(1.昆明醫科大學附屬延安醫院檢驗科　650051；2.昆明醫科大學第一附屬醫院皮膚科　650032)

·綜述·

腸道病毒71型與臨床手足口病關系的研究進展*

張勝1，王楊1△，李凌佳2綜述，高輝1審校

(1.昆明醫科大學附屬延安醫院檢驗科650051；2.昆明醫科大學第一附屬醫院皮膚科650032)

腸道病毒71型；手足口??；實驗室檢測

手足口病(HFMD)是一種常見的由腸道病毒引起的兒童感染性疾病，主要由柯薩奇病毒A型16(CA16)和腸道病毒(EV)71型感染引起。多數患者表現為一種輕微的自限性疾病，少數病例可迅速發展為致命的中樞神經系統并發癥，特別是由EV71引起的感染，而小于3歲的兒童是最容易發生EV7感染且中樞神經系統最易受累[1-2]。常伴隨腦干腦炎、無菌性腦膜炎、腦脊髓炎、小兒麻痹癥樣癱瘓、心肺衰竭，甚至導致死亡，且腦干腦炎恢復后的兒童可能遺留嚴重的神經病學方面的后遺癥[3]?，F就EV71的生物學特性、致病機制及實驗室檢測進行總結。

1EV71分子生物學特性

1.1EV71分子特性腸道病毒和柯薩奇病毒同屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，EV71是無包膜和突起的單股正鏈小RNA病毒，直徑約33～35 nm，病毒基因組長度大約為7.5 kb。病原體由一個60個亞單位的二十面體的衣殼包繞病毒基因組RNA構成，它的基因組包含了一個開放閱讀框(ORF)，兩端為5′和3′非編碼區(UTR)。其中5′非編碼區包含了一個涉及RNA復制的四葉式固定結構和一個指導病毒蛋白質翻譯的內在核糖體進入位點(IRES)[4-6],在3′-UTR的末端含有多聚腺苷酸尾巴，UTR不僅可以保證病毒蛋白的正常表位，還可以維護病毒基因的穩定性，決定病毒的毒力[7]。而開放閱讀框編碼一種250×103的多聚蛋白，包括P1、P2和P3三個區，組成病毒衣殼的結構蛋白(VP1、VP2、VP3及VP4)和參與病毒復制的7種非結構蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C及3D)。其中VP1是最具致病性的也是最重要的一種結構蛋白，其變化是EV71免疫原性的主要決定因素，單個氨基酸的變化可以明顯改變免疫反應和中和抗體反應的敏感性；且包含主要的中和表位，可以用于病毒的鑒定和進化分析[8]。EV71 VP1蛋白包含297個氨基酸，大小為32×103，具有“果凍卷”型的β-桶狀結構和疏水性口袋因子。分布于病毒表面的VP1β桶狀結構區，存在一個深凹，被認為是EV71 病毒的黏附位點，也被稱為峽谷樣結構[9]。

1.2EV71的生物學亞型EV71被分為3種基因型，分別是A、B和C，其中B和C劃分為B1-B5、C1-C5。而一個單獨的B0基因亞型最近是在荷蘭1963～1967年的回顧性分析中EV71毒株上得以確認。也有研究表明EV71 C4亞基因型應該歸類為一種新的基因型D中。此外，突變和重組是EV進化過程中常見的現象，EV3D聚合酶的失真是導致基因組復制過程中突變的主要原因，正是由于高發的突變率和重組率，為臨床的治療和疫苗的研制帶來了困難。

2EV71引起HFMD的致病機制

2.1EV71的感染機制及過程發病機制是一個復雜、多步驟過程，病毒和受體的相互作用是激發感染的第一步[10]。EV71起初吸附在細胞表面的吸附因子上，隨后進入細胞和受體相互作用，EV71通過網格蛋白介導的內吞作用進入細胞與受體相互作用，細胞內病毒RNA-dependent 翻譯，多聚蛋白被2A和3C蛋白酶裂解為結構蛋白和非結構蛋白。非結構蛋白主要參與病毒核酸RNA正負鏈的合成，其中正鏈病毒RNA被包裝成為衣殼前體，最終成為具有感染性的病毒顆粒[11]。而VP1作為病毒結構蛋白，主要功能是協助病毒感染，結合細胞受體，參與吸附、穿入、脫殼等過程。目前的研究與其有關的有清道夫受體B2(SCARB2)、選擇素P糖蛋白配體1(PSGL-1)、人膜聯蛋白Ⅱ(Anx2)和硫酸乙酰肝素類糖胺聚糖。其中SCARB2是主要表達于核內體及溶酶體膜的Ⅲ型糖蛋白，分布于重癥HFMD患者肺組織支氣管上皮、細支氣管上皮、炎癥細胞及肺泡上皮細胞；PSGL-1表達于骨髓細胞及受激后的T淋巴細胞，作為細胞黏附因子P、E、L高親和性配體僅分布于重癥HFMD患者肺組織炎癥細胞，可能在重癥HFMD的感染過程中具有一定作用[9]。

2.2EV71致病機制與機體的反應EV71感染后通過病毒編碼蛋白酶作用導致宿主蛋白翻譯停止，誘導細胞發生凋亡。研究發現EV71可以通過幾種機制阻斷Ⅰ型干擾素(IFN)的表達，比如降低細胞胞質內病毒RNA感受黑色素瘤分化相關基因S(MDAS)減少Ⅰ型IFN的表達而降低宿主抗病毒反應[12]。相關文獻研究數據顯示，EV71復制誘導細胞周期停止在S期，停在S期的細胞為EV71的感染提供了優越的條件，這一過程主要是由非結構蛋白3D介導引起，由此能更深一步理解EV71致病的機制。

目前已有研究者通過對原位EV71病毒RNA定位和詳細的免疫病理分析發現，嚴重的感染者炎癥細胞在不同的組織中的分布和分類不等，中樞神經系統伴有巨噬細胞和中性粒細胞浸潤的EV71感染易導致神經系統病變；另外，在一項伴有腦膜腦炎中樞神經并發癥的患者血清中炎性因子與嚴重程度相關性的病例對照研究中顯示，白細胞介素(IL)-4、IL-6、IL-10、IFN-α和IFN-γ明顯升高，可能與EV71感染誘導的中樞病變相關[13]。國內研究結果顯示，IL-6和TNF-α參與EV71 感染所致的HFMD發病的病理、生理過程，并與疾病的嚴重程度有關[14]。

3EV71實驗室檢測方法

EV感染的檢測和血清型鑒別傳統方法是病毒分離和免疫熒光檢測法(IFA),但是很耗時且需要特殊實驗設備[15]。傳統EV71的檢測最初是依賴病毒培養和鑒定及血清學診斷，但同樣是耗時或是很高的假陽性率，現就EV不同檢測方法比較如下。

3.1培養病毒培養可以用糞便、咽喉拭子、水泡液體作為標本，糞便被認為是最適合的標本類型，因為它可以更長維持病毒存活，但是運輸時間應該盡可能短。分離和培養病毒的傳統診斷方法操作較為繁瑣，且假陰性率較高，影響臨床診斷和治療。

3.2免疫學檢驗診斷中和抗體檢測，通過與特定血清型抗血清酸發生中和來識別相關血清型，空斑中和試驗普遍應用于EV71中和抗體檢測。此外，ELISA IgM檢測已經應用于快速診斷，從感染后的第一周至數周都保持很高的敏感性[8]。應用ELISA法檢測血清EV71 IgM抗體對于現癥感染的檢查具有重要意義，其有可操作性強、簡便快速、準確等優點，在實驗室血清抗體檢測中應用廣泛，對于檢測設備的要求不高，適合在基層醫院推廣。

3.3分子生物學檢測目前，核酸檢測成為EV病原學檢測新的“金標準”，發揮出無可比擬的優勢。其是基于PCR原理的一種更快捷、特異和敏感的檢測和鑒別EV亞型的試驗方法。常用的具有很高特異性和敏感性的用來檢測EV71的包括反轉錄PCR(RT-PCR)、實時定量反轉錄PCR(qRT-PCR),其次還有內標多重熒光RT-PCR、基因芯片技術等分子診斷技術方法[16]。

3.3.1RT-PCR技術目前臨床診斷EV71感染最為常用的方法之一，其可對VP1基因進行擴增和核酸測序，以VP1蛋白作為目標檢測抗原，對低載量水平的RNA可以測定，常用來對EV這種RNA病毒感染進行診斷和血清型鑒定。但與qRT-PCR相比，其靈敏度和特異度都不夠高，且操作繁瑣，測定周期長，具有較高的假陽性率及假陰性率，對臨床的診斷和治療均具有一定的影響，導致其在臨床的應用價值不斷下降。此外，因其需要先進的設備和昂貴的試劑，很難應用于發展中國家或是現場流行病學調查。

3.3.2qRT-PCR簡化了傳統的分子診斷過程，提高了靈敏度和特異度，有效地避免了交叉污染和手工操作誤差，達到了對檢測的各個反應時段的實時監測、定量，被認為是目前檢測EV71及EV、CA16的首選方法。

3.3.3其他檢測方法一種快速、可靠、經濟、有效的核酸擴增分子檢測方法——環介導等溫擴增法在2000年首次建立[8]，與RT-PCR相比，具有更高的靈敏度和特異度，操作簡便快捷，具有廣闊的應用前景。此外，有研究顯示已成功發現了基于基因檢測的高通量二代測序方法可以直接對臨床標本進行EV71全基因組測序，以對病毒變異和進化提供重要的認識依據[17]。目前還成功發展和驗證了一種敏感的自動化多通路一次性檢測實時RT-PCR方法來檢測EV，對HFMD的臨床管理和暴發流行疫情控制有重要作用[18]。

3.4聯合檢測相關文獻報道RT-PCR與IgM聯合檢測可以提高EV71感染引起的嚴重HFMD早期診斷檢測率，所以在臨床上被強烈推薦[19]，此外，如白細胞(WBC)、降鈣素原(PCT)、IL-6、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)等項目聯合檢測在HFMD的早期診斷中的臨床價值及有效性也得到了認可[20]。

4小結

雖然近年來對HFMD的臨床研究不斷深入，但EV71基因型變異，以及其易與其他不同亞型的交叉感染給HFMD的臨床的診療不斷帶來新的挑戰。隨著分子生物學技術的不斷發展，相信在不久的將來，EV71的實驗室檢測可以達到精準醫學水平，并能更加成熟地應用于臨床，在HFMD的個體化防治中發揮重要作用。

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云南省應用基礎研究項目(2014FB080)。

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