核酸檢測方法在血液HBV-DNA檢測中的應用

曾雪珍，葉賢林，曾勁峰

(廣東省深圳市血液中心　518035)

·臨床研究·

核酸檢測方法在血液HBV-DNA檢測中的應用

曾雪珍，葉賢林，曾勁峰

(廣東省深圳市血液中心518035)

目的研究核酸檢測方法在血液HBV-DNA檢測中的應用價值。方法選取2006年6月至2012年6月深圳市347 160例血清學檢測陰性的獻血者血液標本為研究對象，對其實施羅氏COBAS AMPLICOR血液核酸篩查、PCR-微流芯片法、實時熒光PCR法及NOVARTIS TMA進行核酸篩查以統計攜帶有HBV的血液標本數量，同時，所有獻血者追蹤檢測丙氨酸氨基轉移酶和乙型肝炎兩對半標志物。結果347 160例血清學檢測陰性的獻血者通過實施核酸檢測，共檢測出乙型肝炎表面抗原陰性及HBV-DNA陽性129例，占0.37‰。其中，窗口期19例，占檢出總例數14.7%；隱匿性感染110例，占84.3%。結論NAT靈敏度高，能夠有效篩選出獻血者血液標本中攜帶的HBV，對保障血液安全具有重要意義，值得在今后臨床檢測工作中積極推廣使用。

核酸擴增技術；乙型肝炎病毒；乙型肝炎表面抗原；脫氧核糖核酸

輸血是將獻血者的血液通過靜脈輸注的方式傳輸至患者體內，以起到良好的輔助治療作用的一種治療方法，在當前醫療機構中得到了廣泛的應用。然而，在獻血者中，乙型肝炎病毒感染組不可避免地夾雜其中，對輸血者的身體健康帶來了極大的隱患。根據當前醫學臨床研究可知，乙型肝炎病毒(HBV)是一種脫氧核糖核酸病毒，屬于嗜肝DNA病毒科[1]。目前在我國境內HBV感染率約為65%，而乙型肝炎表面抗原攜帶率約占到了總人口數的7%，乙型肝炎病毒(HBsAg)屬于傳染性疾病，已經被世界衛生組織列為嚴重的全球性衛生問題。如何有效降低由血液輸注造成的HBV感染率已經成為各國醫學界專家學者研究的重要課題。在血液標本檢測工作中，核酸擴增技術(NAT)可縮短檢測“窗口期”，降低漏檢感染病毒率等優點日漸凸顯，并且此種方法已經成為西方發達國家病毒篩查工作的重要手段之一[2]。為此，本研究針對核酸檢測方法在血液HBV-DNA檢測的應用價值展開深入分析，以為該種檢測技術的推廣使用提供科學依據，現將結果報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料選取深圳市血液中心2006年6月至2012年6月347 160例血清學檢測為陰性的獻血者為研究對象，其中男185 470例，占53.4%，女161 690例，占46.6%，獻血者年齡18～45歲，平均(31.5±2.5)歲。所有無償獻血者均檢測HIV、梅毒陰性；ABO血型根據紅細胞表面有無特異性抗原(凝集原)A和B來劃分血液類型系統；血液檢測標本均是在全密閉狀態下采集的。排除非研究區間段提供的血液標本，以及含有乙醇成分的血液標本。

1.2檢測方法347 160例獻血者血液標本進行HBsAg金標試紙法，丙氨酸氨基轉移酶(ALT)采用干化學法測試，合格后將采集到的血液標本置于NAT試管中，以3 000 r/min離心15 min，并放置在4 ℃環境中保存[3]。選定后實施羅氏COBAS AMPLICOR血液核酸篩查方法、PCR-微流芯片法、實時熒光聚合酶鏈反應(PCR)法及NOVARTIS TMA進行HBV-DNA檢測。(1)羅氏COBAS AMPLICOR血液核酸篩查方法。首先對檢測血液標本進行核酸全自動提取工作，將所使用的純化試劑洗滌緩沖液、蛋白裂解液、磁珠等放置在瑞士羅氏COBAS AMPLICOR NAT檢測儀上，于匯集池將標本均勻混合后取樣500 μL,并且經過陰陽對照之后放入到儀器，等待1 h后提取自動完成的核酸[4]。其次，向標本加入Mn2+溶液和純化之后的核酸樣液，根據NAT檢測儀檢測步驟要求逐次加入變性液、內標、酶和顯色劑自動完成擴增和檢測工作，之后由操作人員記錄標本的陽性檢測結果。(2)PCR-微流芯片法。本研究中采用上海浩源生物科技有限公司生產的PCR檢測試劑盒，擴增引物為HBV前C及C區設計引物，正反向擴增引物的序列如下所示：5′-TTG CCT TCT GAC TTC TTT CC-3′,5′-CGA GGG AGT TCT TCT TCT AG-3′。擴增的具體循環條件為：50 ℃環境下120 s；95 ℃環境下預變性5 min，94 ℃ 50 s、50 ℃ 50 s、72 ℃ 50 s 2個循環，90 ℃ 40 s、50 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s共32個循環[5]。使用DNA500微流芯片來檢測PCR擴增物。利用Caliper L 1000微流芯片分析儀實施HBV定量檢測，并利用檢測儀攜帶的計算軟件計算最終檢測結果[6]。(3)實時熒光PCR法。本研究中所使用的PCR混合物包括正向引物(nt1743～1434)5′-ACG TCC TTT GTT TAC GTC GCG T-3′和反向引物(nt1743～1722)5′-CCC AAC TCC TCG CAG TCC TTA A-3′。擴增程序：50 ℃環境下溫育120 s，94 ℃ 120 s、60 ℃ 30 s 1個循環，94 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s共39次循環，在60 ℃條件下進行熒光PCR定量分析[7]。(4)NOVARTIS TMA。采用Novartis Procleix Ultrio Discriminatory TMA對待檢測血液標本進行HBV-DNA檢測，檢測樣品嚴格按照世界衛生組織國際標準品HBV(97/750)進行校準。(5)HBV陽性結果的追蹤研究。進行乙型肝炎兩對半，ALT檢測，HBsAg同時用兩種ELISA試劑測定，陽性結果用中和實驗確證。

1.3質量控制每天室內質控物由試劑公司合作配置，按試劑說明書要求判讀結果有效性。2007年開始參加原衛生部和澳大利亞的室間質評(NRL，2011年后更改為CITAC)。

1.4統計學處理采用Stata11.0統計軟件進行處理數據及統計學分析，分類變量資料采用Fisher法，連續變量資料采用兩獨立樣本Mann-WhitneyU檢驗。所有的統計檢驗均采用雙側檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1核酸檢測結果所有347 160例獻血者通過實施核酸檢測，共檢測出HBsAg陰性、HBV-DNA陽性129例，占0.37‰[95%置信區間(CI)為1∶3 224～1∶2 265，P<0.05]。其中，羅氏COBAS AMPLICOR血液核酸篩查方法檢出8例，95%CI為1∶9 124～1∶1 999；實時熒光PCR法檢出11例，95%CI為1∶11 779～1∶2 831；PCR-微流芯片法檢出3例，95%CI為1∶22 831～1∶1 611；NOVARTIS TMA多核酸檢測107例，95%CI為1∶2 463～1∶1 671。

2.2HBsAg陰性及HBV-DNA陽性血清學標志物分布情況本研究共檢測出HBsAg陰性，HBV-DNA陽性129例。其中，處于窗口期19例，占檢出總例數的14.7%；隱匿性感染110例，占84.3%。所有110例隱匿性感染中乙型肝炎核心抗體(HBcAb)陽性及乙型肝炎表面抗體(HBsAb)50例，占38.8%；HBcAb陽性及HBsAb陽性45例，占34.9%；單純HBsAb陽性15例，占11.6%。

2.3對核酸陽性結果獻血者的追蹤結果129例HBV-DNA陽性獻血者進行了追蹤，成功追蹤到42例獻血者，其中7例獻血者追蹤到HBsAg血清轉換到陽性的現象，且HBcAb轉換為陽性，呈窗口期特征，占總例數的18.0%。

2.4室間質評結果2007年開始每年參加原衛生部臨檢中心的質評，結果與預期結果完全一致。澳大利亞的NRL共15支編號A～O，按要求與血液標本同等檢測，2007年參加3次，其中HBV-DNA、HCV RNA與預期結果完全一致。HIV RNA 第2次N號標本為B亞型稀釋標本，首次未檢出，后改進探針后檢出。2008年參加3次，全部符合，其中第一次L號為HBV和HIV合并感染，HIV載量低于目前所有的檢測方法，本實驗室均檢出。2008年后均為100.0%符合。

3討論

HBV是一種經血傳播，且危害極大的一種病毒性傳染病，而引起HBV傳播的途徑主要有以下幾種：血源性傳播、醫源性傳播、母嬰傳播、生殖細胞傳播、密切接觸傳播(性接觸為主)、吸血昆蟲(蚊子、臭蟲等)傳播等[8]。隨著病毒防治及健康宣教工作的廣泛開展，生殖細胞傳播、密切接觸傳播、吸血昆蟲傳播等途徑所導致的HBV傳播率得到了有效控制。因而，血源性傳播已經成為乙型肝炎的主要傳播途徑。特別是當前輸血治療在醫療機構的各個科室中已經得到了廣泛的使用，更是進一步加劇了HBV防治工作的壓力。

當前我國范圍內的大部分血站一直在單純使用ELISA，并將HBsAg作為HBV感染的獻血者篩查手段與指標。但是，血液標本檢測過程中由于窗口期、低水平乙型肝炎感染、基因變異等客觀因素的存在，使獻血者篩查工作并沒有取得理想效果，現代輸血安全的需要得不到有效滿足[9]。所以，如何降低血站血液標本中HBV“窗口期”感染風險已經成為血液檢測領域亟待解決的問題。

經過不斷開展的臨床研究證實，人體一旦遭受到外界病毒感染，通常情況下最先被檢測出來的就是病毒核酸。HBV-DNA為乙型肝炎的脫氧核糖核酸，即HBV基因，是當前臨床判定乙型病毒性肝炎感染的最直接、特異性較強及反應靈敏度較高的指標。如果獻血者血液標本經過檢測后發現HBV-DNA結果呈陽性，則提示該獻血者體內存在著HBV復制和潛在傳染性。而HBV-DNA越高則表示病毒基因復制越嚴重，傳染性隨之提升[10]。因此，通過檢測HBV-DNA已經成為篩選血站血液標本HBV感染，以及提高輸血安全性的關鍵手段。隨著醫學技術的快速發展，國外醫學界已經廣泛采用NAT來縮短病毒基因檢測的“窗口期”，實現及時篩查出HBV感染的血液標本的目的。相較于ELISA等血清學檢測方法，核酸檢測將HBV檢測的 “窗口期”由原來的50 d縮短至25 d，血液安全由此可得到更好保障。國外將其應用在臨床血液檢測工作中的報道已經屢見不鮮。

本研究對347 160例陰性血樣獻血者在不同時間段分別采用羅氏PCR法，PCR-微流芯片法和實時熒光PCR法及NOVARTIS TMA進行血液核酸常規篩查。共檢出129例HBV-DNA陽性標本，陽性總比率為1∶2 691，占0.37‰，明顯高于西方發達國家，主要原因是我國為肝炎的高發區，人群中HBsAg攜帶率為7.18%，HBV流行率高達60%以上。本次檢出129例HBV-DNA陽性，其中羅氏COBAS AMPLICOR血液核酸篩查方法檢出8例，實時熒光PCR法檢出11例，PCR-微流芯片法檢出3例，NOVARTIS TMA多核酸檢測107例?？迫A半自動方法由于前期采用離心富集病毒方法，該方法富集病毒效果差，檢出比率相應比其他方法低。而NOVARTIS TMA方法由于采用單人份檢測，上樣量為500 μL，檢出的陽性比率較其他方法高。其余方法由于標本采集時間、取樣量、提取和擴增方法不同，檢出比率稍有不同。盡管各種檢測方法檢出例數存在著一定程度的差異，但是不可否認的是相較于臨床常用的ELISA，其診斷結果的準確性更高，對于臨床廣泛使用的輸血治療起到了有效的保障。進一步研究發現，檢測出的129例HBsAg陰性、HBV-DNA陽性獻血者，其中，窗口期患者19例，占檢出總例數的14.7%；隱匿性感染110例，占84.3%。所有110例隱匿性感染獻血者中HBcAb陽性及HBsAb陰性50例，占38.8%；HBcAb陽性及HBsAb陽性45例，占34.9%；單純HBsAb陽性15例，占11.6%，進一步證實了現有檢測方法存在的弊端與不足。

然而，結合國內外既有研究成果及本科室工作經驗，提示NAT推廣使用需要解決以下兩個問題：首先是持續維持核酸檢測運行經費問題。NOVARTIS TMA核酸檢測系統檢測結果是上述檢測方法中最佳的，但是該系統與國內目前血站實驗室檢測系統存在著明顯的數據信息對接問題，缺乏足夠的配套資金開展相應的研究。其次，需要明確一個符合標準的實驗室規范化檢測流程并做好核酸檢測實驗室質量控制和人員的技術培訓工作。由于NAT在國內尚未得到廣泛應用，各地區醫療從業人員對其認知與操作步驟存在一定的不足，需要在此方面花費較大精力予以妥善解決。

綜上所述，NAT靈敏度高，能夠有效篩選出獻血者血液標本中攜帶的HBV，對血液安全起到了重要的保障作用，值得在今后臨床檢測工作中積極推廣使用。

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2016-01-28修回日期：2016-03-18)

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.12.041

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1673-4130(2016)12-1695-03