涎腺腺樣囊性癌微血管參數與腫瘤微血管模式的相關性研究

王蕊，李立恒，謝麗娟，胥愛文，王鐘華

（河北北方學院附屬第一醫院口腔科，河北 張家口 075000）

涎腺腺樣囊性癌微血管參數與腫瘤微血管模式的相關性研究

王蕊，李立恒，謝麗娟，胥愛文，王鐘華

（河北北方學院附屬第一醫院口腔科，河北 張家口 075000）

目的 探討涎腺腺樣囊性癌微血管參數與腫瘤微血管模式之間的相關性。方法收集2005年1月至2015年7月我院涎腺腺樣囊性癌患者(SACC組)148例，正常腮腺組織(對照組)50例，采用免疫組化染色方法檢測兩組受檢者的轉錄活化因子-3(STAT3)、血管內皮生長因子(VEGF)mRNA及蛋白表達水平，分析其與微血管密度(MVD)之間的相關性。結果SACC組患者的STAT3和VEGF陽性表達率分別為32.0%和40.0%，均明顯高于對照組的19.0%和18.0%，差異均具有統計學意義(P＜0.05)；SACC組患者的STAT3、VEGF mRNA表達水平分別為(1.12±0.56)和(1.10±0.29)，均明顯高于對照組的(0.82±0.31)和(0.72±0.26)，差異均具有統計學意義(P＜0.05)；SACC組患者的STAT3、VEGF蛋白表達(3.23±1.99、2.56±1.86)與對照組(1.96±0.86、1.99±0.86)比較差異具有統計學意義(P＜0.05)；STAT3及VEGF在SACC組中不同類型組織、有無淋巴結轉移、TNM分期方面比較差異均具有統計學意義(P＜0.05)；STAT3與VEGF表達呈正相關(r=0.85)；STAT3及VEGF蛋白表達水平與MVD差異表達具有相關性(r= 0.63，0.85)。結論涎腺腺樣囊性癌微血管參數STAT3與VEGF與腫瘤微血管模式MVD之間具有相關性，在調控涎腺腺樣囊性癌的血管生成方面，有望作為治療靶點。

轉錄活化因子-3；血管內皮生長因子；涎腺腺樣囊性癌；微血管密度；腫瘤微血管模式；相關性

腺樣囊性癌(Adenoid cystic carcinoma，ACC)是頜面部腫瘤中發病率較高的腫瘤，也是涎腺最常見的惡性腫瘤，約占所有涎腺腫瘤的14.5%，約占全部涎腺惡性腫瘤的40%，極易發生局部浸潤和神經侵襲轉移，且其浸潤性極強，易侵入血管，造成血運轉移，預后不佳，但本病帶瘤生存時間相對較長[1-2]。腫瘤的生長有賴于血管的生成，作為量化血管形成程度的微血管密度是血管形成的效應標志，同時還可作為反映腫瘤生物學良惡性情況的重要參數。近年來研究發現，在乳腺癌癌、肝癌、膽管癌、胃癌等多種腫瘤中STAT3及VEGF在調控腫瘤血管的生成中具有重要的作用[3]。本研究收集涎腺腺樣囊性癌患者STAT3及VEGF的表達情況及MVD參數資料，通過分析STAT3及VEGF與SACC微血管新生及模式的演變規律，為腺樣囊性癌的抗血管生成治療研究提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2005年1月至2015年7月我院涎腺腺樣囊性癌患者148例，其中男性87例，女性61例，年齡39～74歲，平均(55.3±10.7)歲；均為單側腺體發病，其中左側發病者77例，右側發病者71例，發病部位位于舌下腺者27例，位于腮腺者101例，其余20例位于頜下腺。臨床分期及病理類型參照國際WHO的診斷標準[4]進行分析判斷，其中Ⅰ期40例，Ⅱ期35例，Ⅲ期39例，Ⅳ期34例；篩孔狀51例、管狀型50例、實體型47例。隨機將148例患者分為對照組和實驗組，每組74例。

1.2 治療情況 本研究均為來院的初診病例，均在我院完成手術治療，其中單純使用手術方法治療的有85例，加用了放療等輔助治療手段的有63例，舌下腺者27例中有12例行口底的微波治療，10例行上半頸部清掃，5例行頜下清掃加下頜骨切除術；位于腮腺者101例中行腮腺淺葉切除者38例，行全葉切除者32例，行殘葉切除者21例，行腮腺癌聯合根除術者6例，行擴大切除術者4例；20例位于頜下腺者中行頜下三角清掃術者8例，行聯合根治術者8例，行上半頸清掃術者2例，行頜下三角清掃家頜骨切除者2例；加用放療輔助治療的63例患者中均采用面頸部聯合的對穿野照射，其中有24例加入了根治性的同側頸部照射，15例加入了預防性的同側頸部照射。區域淋巴結的放療劑量為50～70 Gy，原發灶的放療劑量為30～70 Gy。對隨訪中發生復發的68例病例行手術治療的有32例，其中15例追加了放療。

1.3 方法

1.3.1 主要試劑、細胞與儀器 試劑：免疫組化試劑盒(武漢博士德)，PCR試劑盒(上海碩盟生物)，HRP標記山羊抗兔IgG，HRP標記山羊抗小鼠IgG(上海碧云天生物)，一抗：STAT3及VEGF和β-actin小鼠多克隆IgG(美國Santa Cruz公司)。儀器：轉膜儀及電泳儀(美國伯樂公司)，高轉速冷凍離心機(德國BiofugeStratos)，倒置相差顯微鏡(日本奧林巴斯)，-80℃-4℃冰箱(日本松下)，高壓消毒箱(美國Tuttnauer)，PCR儀(澳大利亞Rotor-gene)。

1.3.2 免疫組化檢測STAT3及VEGF表達情況 每組選取25例病例進行試驗，石蠟切片脫蠟至水→3%甲醇-H2O2室溫孵育5 min，以清除內源性過氧化物酶活性→雙蒸水沖洗，0.01 mPBS洗5 min→抗原修復后，0.01 mPBS洗3次，每次5 min→滴加10%正常山羊血清封閉游離的結合位點，減少非特異性染色→滴加一抗4℃冰箱過夜→0.01 mPBS洗3次，每次5 min→滴加生物素標記的二抗IgG，37℃孵育30 min→0.01 mPBS洗3次，每次2 min→滴加辣根酶HRP標記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30 min，0.01mPBS每次5 min，洗3次→DAB顯色劑顯色3～5 min，自來水沖洗終止顯色→蘇木素復染→酒精梯度脫水→二甲苯透明→封片。結果判定：倒置顯微鏡下細胞胞漿胞膜出現深棕黃色的染色定義為陽性細胞。

1.3.3 RT-PCR(半定量逆轉錄聚合酶鏈反應)方法 隨機選取涎腺腺樣囊性癌組25例，同時隨機選取正常腮腺組織(對照組)25例，提取病變組織總RNA。行逆轉錄cDNA反應體系。由逆轉錄產物2 μL以及18sRNA或者一抗組成。按照RT-PCR操作步驟進行：預變性反應條件為5 min、95℃，梯度變性反應，30 s 94℃、30 s 60℃、60 s 72℃、7 min 72℃遞減，共30次循環。所得PCR產物行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果行凝膠成像系統分析。對得到的半定量結果進行對比分析，采用量化的吸光度積分值比較。

1.3.4 Western blotting方法 隨機選取涎腺腺樣囊性癌組25例，同時隨機選取正常腮腺組織(對照組)25例，提取病變組織蛋白。按照SDS-PAGE凝膠電泳操作步驟進行，采用半干法轉膜，加入一抗之后，4℃至少6 h孵育過夜，洗膜3次，每次5 min，再行二抗37℃孵育1 h，行ECL光化學法顯色，彩色圖像分析系統對吸光度測定。

1.4 統計學方法 數據分析運用SPSS 21.0統計軟件。符合正態分布的數據采用均數±標準差(±s)表示，遵循正態分布而且方差齊性，兩兩比較采用LSD檢驗。應用Kruskal-wallis H檢驗進行多組間數據的比較，應用Mann-whitney U檢驗法進行兩兩數據之間比較，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 免疫組織化學法檢測STAT3及VEGF表達水平 STAT3陽性細胞主要位于胞漿與胞核，其表現為胞漿及胞核呈棕色或者黃色，STAT3在SACC組與對照組中陽性表達率分別為32.0%與19.0%，兩組比較差異具有統計學意義(P＜0.05)；VEGF主要位于腫瘤細胞的胞漿，VEGF在SACC組與對照組中陽性表達率分別為40.0%與18.0%，兩組比較差異具有統計學意義(P＜0.05)，見圖1。

2.2 涎腺腺樣囊性癌對STAT3及VEGF mRNA表達的影響 涎腺腺樣囊性癌與對照組STAT3及VEGF mRNA表達情況比較，SACC組STAT3及VEGF mRNA的表達值高于對照組，組間比較差異具有統計學意義(P＜0.05)，STAT3與VEGF表達呈正相關，見表1。

2.3 涎腺腺樣囊性癌對STAT3及VEGF蛋白表達的影響 涎腺腺樣囊性癌與對照組STAT3及VEGF蛋白表達情況比較，SACC組STAT3及VEGF蛋白的表達值高于對照組，組間比較差異具有統計學意義(P＜0.05)，STAT3與VEGF表達呈正相關，見表2。

2.4 STAT3及VEGF表達與SACC臨床參數之間的相關性 STAT3及VEGF在SACC組中不同類型組織、有無淋巴結轉移、TNM分期方面差異具有統計學意義(P＜0.05)；STAT3及VEGF表達在不同性別、年齡、腫瘤分布情況差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表3。

表1 涎腺腺樣囊性癌對STAT3及VEGF mRNA表達的影響(±s)

表1 涎腺腺樣囊性癌對STAT3及VEGF mRNA表達的影響(±s)

組別對照組(n=50) SACC組(n=148)檢驗值P值STAT3 0.82±0.31 1.12±0.56 2.263 0.036 VEGF 0.72±0.26 1.10±0.29 2.369 0.038

表2 涎腺腺樣囊性癌對STAT3及VEGF蛋白表達的影響(±s)

表2 涎腺腺樣囊性癌對STAT3及VEGF蛋白表達的影響(±s)

組別STAT3VEGF對照組(n=50) SACC組(n=148)檢驗值P值1.96±0.86 3.23±1.99 4.693 0.001 1.99±0.86 2.56±1.86 3.353 0.026

表3 STAT3及VEGF表達與SACC臨床參數之間的相關性

2.5 SACC中STAT3、VEGF的表達水平與MVD的相關性 STAT3及VEGF的蛋白表達水平與MVD差異表達具有相關性，見表4。

表4 SACC組織中STAT3、VEGF的表達與MVD的關系

3 討 論

腺樣囊性癌是頜面部腫瘤中發病率較高的腫瘤，也是涎腺最常見的惡性腫瘤，約占所有涎腺腫瘤的14.5%，約占全部涎腺惡性腫瘤的40%，5年生存率約為20%。極易發生局部浸潤和神經侵襲轉移。腫瘤微血管新生是其浸潤和遠處轉移的前提條件[5-7]。目前評價腫瘤血管生成的標準是采用免疫組化的方法測定腫瘤微血管密度(MVD)。而腫瘤微血管存在多種不同的模式，勢必對腫瘤的進展及預后產生影響，但是有關微血管模式與腫瘤進展以及脈管內癌栓、局部腫瘤浸潤等高危因素的以及預后的關系未見報道[8-9]。近年來涎腺腺樣囊性癌的發病率呈逐年上升的趨勢，雖然治療水平不斷提高，但是患者的生存率并未得到明顯提高，其轉移與復發仍是死亡的主要原因[10]。

國內外目前對涎腺腺樣囊性癌的診斷研究主要集中在病因學、遺傳基因、早期診斷手段的研究，治療方面研究主要集中在放射、化學以及手術方法改進等方面，雖然取得了一定進展，但該病的發病率及死亡率并未得到明顯降低，說明研究的深度尚不足，研究還處于基礎階段尚未應用于臨床[11]。由于涎腺腺樣囊性癌作為惡性腫瘤，對人類生命具有重大的威脅。因此，進一步尋找有關涎腺腺樣囊性癌復發、轉移生物標記物及敏感特異是該病有效治療、提高生存率的關鍵點。其次做好涎腺腺樣囊性癌發病的預防及早期發現，減少其發病率和轉移率，是今后研究的重要方向[12]。

STAT3是重要的核轉錄因子，可通過蛋白酪氨酸激酶或絲氨酸激酶誘導，在細胞因子和生長因子的作用下，可調控靶基因的轉錄，磷酸化并形成二聚體進入細胞核內，從而促進腫瘤細胞的增殖，與血管形成及侵襲轉移具有密切的相關性[13]。VEGF具有增強微血管通透性，特異性作用于血管內皮細胞，為腫瘤的浸潤轉移提供條件，刺激內皮細胞促進腫瘤血管生成。研究表明腫瘤細胞中STAT3過度表達可上調了VEGF的水平，從而具有促進腫瘤的生長的作用[14]。本研究通過分析STAT3及VEGF與SACC微血管新生及模式的演變規律，為腺樣囊性癌的抗血管生成治療研究提供理論依據。結果顯示，在SACC組中STAT3及VEGF的表達明顯高于對照組，組間比較具有統計學意義，STAT3與VEGF表達呈正相關；STAT3及VEGF在SACC組中不同類型組織、有無淋巴結轉移、TNM分期方面差異具有統計學意義；STAT3及VEGF表達在不同年齡、性別、腫瘤部分方面差異無統計學意義；STAT3及VEGF蛋白表達水平與MVD差異表達具有相關性。STAT3和VEGF在SACC中的表達呈正相關，證實血管生成與STAT3與VEGF的表達具有的密切關系。

綜上所述，STAT3和VEGF在SACC中具有標志性作用，且與腫瘤的生長浸潤呈的正相關性，考慮是STAT3通過上調VEGF表達從而誘導血管的生成，促進腫瘤的轉移，因此，推測在涎腺腺樣囊性癌的發生發展過程中STAT3、VEGF起到調控血管生成，進而促進腫瘤轉移的作用，為進一步研究SACC抗血管靶向治療提供了依據。

[1]黃艷,農曉琳.腺樣囊性癌相關基因的研究進展[J].口腔醫學, 2010,30(4):248-250.

[2]Douglas JG,Laramore GE,Austin-Seymour M,et al.Treatment of locally advanced adenoid cystic carcinoma of the head and neck with neutron radiotherapy[J].Int J Radiat Oncol Phys,2010,46(3): 551-557.

[3]Chummun S,McLean NR,Kelly CG,et al.Adenoid cystic carcinoma of the head and neck[J].Br J Plastic Surg,2011,54(6):476-480.

[4]Sauvageau M,Sauvageau G.Polycomb group proteins:mnlti-faceted regulators of somatic stem cells and cancer[J].Cell Stem Cell,2010, 7(3):299-313.

[5]Regine WF,Mendenhall WM,Parsons JT,et al.Radiotherapy for adenoid cystic carcinoma of the palate[J].Head Neck,2013,15(3): 241-244.

[6]閆冰,李龍江.涎腺腺樣囊性癌的治療進展[J].國際口腔醫學雜志, 2009,36(1):41-45.

[7]Norberg-Spaak L,Dardick I,Ledin T.Adenoid cystic carcinoma:use of cell proliferation,bcl-2,expression,histologic grade,and clinical stage as predictors of clinical outcome[J].Head Neck,2010,22(5): 489-497.

[8]Mendenhall WM,Morris CG,Amdur RJ,et al.Radiotherapy alone or combined with surgery for adenoid cystic carcinoma of the head and neck[J].Head Neck,2004,26(2):154-162.

[9]鄭剛,郭傳瑸,俞光巖,等.腺樣囊性癌患者生存預測模型的建立[J].中華口腔醫學雜志,2006,41(6):350-353.

[10]劉文勝,唐平章,祁永發,等.腭部腺樣囊性癌的診治及預后因素的探討[J].中華腫瘤雜志,2014,26(8):485-489.

[11]Perez DE,Alves FA,Nishimoto IN,et al.Prognostic factors in head and neck adenoid cystic carcinoma[J].Oral oncol,2012,42(2): 139-146.

[12]Rhee CS,Won TB,Lee CH,et al.Adenoid cystic carcinoma of the sinonasal tract:treatment results[J].Laryngoscope,2012,116(6): 982-986.

[13]Szanto PA,Luna MA,Tortoledo E,et al.Histologic grading of adenoid cystic carcinoma of these salivary gland[J].Cancer,2011,54: 1062-1069.

[14]Piunti A,Pasini D.Epigenetic factors in cancer development:polycomb group proteins[J].Future Oncol,2011,7(l):57-75.

Correlation between salivary microvascular parameters and microvessel mode.

WANG Rui,LI Li-heng,XIE Li-juan,XU Ai-wen,WANG Zhong-hua.Department of Dentistry,the First Affiliated Hospital of Hebei North University, Zhangjiakou 075000,Hebei,CHINA

ObjectiveTo investigate the correlation between salivary microvascular parameters and microvessel modes.MethodsOne hundred and forty-eight patients with adenoid cystic carcinoma(SACC group)in our hospital and 50 subjects with normal parotid tissue(control group)were collected from January 2005 to July 2015.Activator of transcription 3(STAT3),vascular endothelial growth factor(VEGF)mRNA and protein levels were detected by immunohistochemical staining in the two groups,and their correlations with microvessel density(MVD)were analyzed.ResultsSTAT3 and VEGF positive expression rates in SACC group were 32.0%and 40.0%,respectively,which were significantly higher than 19.0%and 18.0%in the control group(P＜0.05).The STAT3,VEGF mRNA levels were(1.12±0.56)and (1.10±0.29)in SACC group,significantly higher than those in the control group of(0.82±0.31)and(0.72±0.26),with P＜0.05.The two groups had statistically significant difference in STAT3 and VEGF(P＜0.05)with(3.23±1.99)vs (1.96±0.86)and(2.56±1.86)vs(1.99±0.86).In SACC group,STAT3 and VEGF levels showed statistically significant difference between different types of tissue,with or without lymph node metastasis,and TNM staging(P＜0.05).STAT3 and VEGF expression were positively correlated(r=0.85).STAT3 and VEGF protein expression were correlated with the differential expression of MVD(r=0.63,0.85).ConclusionThere is a correlation between salivary microvascular parameters(STAT3 and VEGF)and microvessel mode MVD,which are expected to be as therapeutic targets in the regulation of angiogenesis in adenoid cystic carcinoma.

Activator of transcription 3(STAT3);Vascular endothelial growth factor(VEGF);Adenoid cystic carcinoma;Microvessel density;Microvessel mode;Correlation

R739.8

A

1003—6350（2016）12—1942—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.12.015

2015-11-26)

王蕊。E-mail：55768952@qq.com