應用實時熒光定量PCR技術分析UGT1A1基因啟動子區A(TA)nTAA多態性

徐羽中，陳群蓉，孫順昌△，彭運生

(廣東省深圳市寶安區人民醫院:1.檢驗科；2.輸血科　518101)

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·論著·

應用實時熒光定量PCR技術分析UGT1A1基因啟動子區A(TA)nTAA多態性

徐羽中1，陳群蓉2，孫順昌1△，彭運生1

(廣東省深圳市寶安區人民醫院:1.檢驗科；2.輸血科518101)

摘要:目的建立實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)技術檢測尿苷二磷酸葡糖醛酸基轉移酶1A1(UGT1A1)基因啟動子區A(TA)nTAA序列多態性的方法。方法以16例Gilbert綜合征患者和66例健康對照個體為研究對象，抽提基因組DNA，通過DNA測序確定UGT1A1基因啟動子區A(TA)nTAA序列多態性。同時，設計1對引物和2條TaqMan MGB探針，2條探針的5′端分別標記FAM和VIC染料，探針的3′端則均以MGB修飾。使用實時熒光定量PCR方法擴增并檢測研究對象的UGT1A1基因啟動子區A(TA)nTAA多態性序列，與測序法比較，驗證實時熒光定量PCR方法的靈敏度和特異度。結果應用熒光定量PCR技術檢測，16例Gilbert綜合征患者的UGT1A1基因啟動子區A(TA)nTAA多態性序列均為A(TA)7TAA，46例健康對照個體A(TA)nTAA多態性序列為A(TA)6TAA，其余20例健康對照個體A(TA)nTAA多態性序列為A(TA)6TAA/A(TA)7TAA雜合多態性。上述結果與DNA測序結果完全一致。結論通過實時熒光定量PCR技術檢測UGT1A1基因啟動子區A(TA)nTAA序列多態性的方法具有靈敏度高、特異度強及操作簡單等特點，可在臨床推廣應用。

關鍵詞:UGT1A1基因；多態性；實時熒光定量PCR

尿苷二磷酸葡糖醛酸基轉移酶1A1(UGT1A1)是催化膽紅素轉變為葡糖醛酸膽紅素的關鍵酶之一[1]。UGT1A1酶是UGT1A1基因的編碼產物，UGT1A1基因突變會導致血清膽紅素升高，依據膽紅素升高程度由低到高分別命名為Gilbert綜合征(20～60 μmol/L)、Ⅰ型Crigler-Najjar綜合征(>60～340 μmol/L)、Ⅱ型Crigler-Najjar綜合征(>340 μmol/L)[2]。Gilbert綜合征是以間歇性非溶血性黃疸為病理特征的良性遺傳性疾病，患者血清膽紅素輕度升高，其臨床表現為長期間歇性黃疸[3]。在UGT1A1基因啟動子中存在A(TA)nTAA微衛星多態性，其中(TA)重復拷貝數越多，UGT1A1酶活性越低[4]。A(TA)6TAA和A(TA)7TAA是人群中兩種常見多態性，非洲人群偶見A(TA)5TAA多態性，高家索人群偶見A(TA)8TAA多態性。在中國人群中僅發現A(TA)6TAA和A(TA)7TAA兩種多態性序列[5]。研究發現A(TA)nTAA多態性與伊立替康(irinotecan)、阿扎那韋(atazanavir)等藥物的不良反應有關，群體遺傳學研究還顯示美國籍非洲人群中A(TA)7TAA多態性與乳腺癌的易患性存在相關[6]。因此，UGT1A1基因啟動子A(TA)nTAA多態性檢測在臨床具有重要的意義。本研究將試圖建立檢測A(TA)nTAA多態性的實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)技術。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2009年10月至2013年4月在本院就診的16例Gilbert綜合征患者，其中男9例，女7例，年齡15～46歲。Gilbert綜合征診斷依據包括臨床表現、實驗室檢查及基因突變分析。診斷標準為臨床出現間歇性非溶血性黃疸、升高的膽紅素以游離膽紅素為主、排除肝膽疾病、排除溶血因素、檢測到UGT1A1基因突變。選擇同期健康體檢的66例健康者，其中男36例，女30例，年齡18～56歲。所有研究對象的UGT1A1基因啟動子中A(TA)7TAA多態性序列通過PCR擴增并測序確定，具體方法見文獻[7]。本研究經過醫院倫理委員會批準，所有研究對象均被告知研究內容，并同意參與本研究。研究對象的基因組DNA為-30 ℃冰箱保存的經苯酚-氯仿抽提制備的基因組DNA。

1.2方法

1.2.1儀器實時熒光定量PCR儀為LightCycler 480Ⅱ擴增儀(瑞士羅氏診斷公司制造)。

1.2.2引物及探針設計在UGT1A1基因(GenBank NM_000463.2)啟動子區及外顯子1上設計1對引物，擴增基因的啟動子區及外顯子1的部分序列。上游引物序列為5′-CAT TAA CTT GGT GTA TCG ATT GGT-3′，下游引物序列為5′-AGC AGG CCC AGG ACA AGT-3′。與A(TA)6TAA序列雜交的探針1序列為FAM-TTG CCA TAT ATA TAT ATA TAA GTA GGA-MGB，與A(TA)7TAA序列雜交的探針2序列為VIC-TGC CAT ATA TAT ATA TAT ATA AGT AGG A-MGB，其中FAM與VIC為熒光染料，探針3′ 端以小溝聚合物(MGB)修飾。引物合成、探針合成及修飾均由上?；瞪锛夹g有限公司完成。擴增片段長度為132 bp [A(TA)6TAA]或134 bp[A(TA)7TAA]。

1.2.3實時熒光定量PCR檢測PCR反應在96孔反應板中進行，反應總體積為50 μL 。反應體系含75 mmol/L Tris-HCl (pH8.8)、20 mmol/L (NH4)2SO4、0.01%吐溫20、3.0 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L dNTPs、0.2 μmol/L引物/條、0.2 μmol/L探針/條、0.4 U Taq DNA聚合酶、100 ng基因組DNA。PCR擴增程序為首先95 ℃變性5 min，然后進入40個擴增循環，每一循環包括95 ℃變性15 s，60 ℃雜交1 min，熒光采集模式設為60 ℃單點采集。結果分析模式為終點基因分型，X軸為FAM熒光強度，Y軸為VIC熒光強度。

1.2.4方法學評價讀取實時熒光定量PCR檢測的A(TA)nTAA多態性結果，并與以前的測序結果進行比較，探討實時熒光定量PCR檢測A(TA)nTAA多態性的靈敏度和特異度。

2結果

2.1實時熒光定量PCR技術能檢測分型A(TA)nTAA多態性通過實時熒光定量PCR技術，本研究標本全部成功擴增。終點基因分型法顯示，16例Gilbert綜合征患者的UGT1A1基因啟動子區A(TA)nTAA多態性序列均為A(TA)7TAA，46例健康者A(TA)nTAA多態性序列為A(TA)6TAA，其余20例健康者A(TA)nTAA多態性序列為A(TA)6TAA/A(TA)7TAA雜合多態性序列。實時熒光定量PCR技術能分型全部個體UGT1A1基因啟動子區的A(TA)nTAA多態性序列。

2.2實時熒光定量PCR技術分型A(TA)nTAA多態性具有高的靈敏度和特異度通過實時熒光定量PCR技術，16例Gilbert綜合征患者和66例健康者UGT1A1基因啟動子區A(TA)nTAA多態性序列均被成功檢測，與測序一致，檢測靈敏度達100%。通過與測序結果比較，實時熒光定量PCR技術分型檢測UGT1A1基因啟動子區A(TA)nTAA序列多態性的結果與DNA測序結果完全相符，且3種基因型散點圖分布在3個明顯不同區域，每一區域的點較為集中，因此實時熒光定量PCR技術分型檢測A(TA)nTAA多態性的特異度達100%。

3討論

在UGT1A1基因啟動子中存在A(TA)nTAA微衛星多態性，基因中TA重復序列拷貝數越多，UGT1A1酶活性越低，研究顯示TA重復序列每增加1個拷貝，UGT1A1酶活性就降低30%[8]。伊立替康、氟尿嘧啶與亞葉酸聯合用藥是目前臨床治療轉移性結腸癌、直腸癌的一線藥物，伊立替康在治療過程中有時會出現骨髓抑制和遲發性腹瀉等不良反應，這些不良反應與個體UGT1A1基因啟動子中A(TA)nTAA多態性存在相關[9]。研究顯示UGT1A1基因啟動子中攜帶(TA)7TAA的個體比攜帶(TA)6TAA個體更能耐受阿扎那韋治療導致的黃疸[10]。群體遺傳學研究顯示在美國籍非洲人群中，UGT1A1基因啟動子中攜帶A(TA)7TAA多態性序列個體的乳腺癌易患性增加[11]。因此UGT1A1基因啟動子中A(TA)nTAA多態性檢測在臨床具有重要意義。

A(TA)nTAA多態性屬于短串聯重復序列(STR)，傳統檢測方法有單鏈構像多態性分析、變性梯度凝膠電泳、毛細管電泳、變性高效液相色譜等[12]。這些檢測技術各有自身的特點，但也存在一些缺陷，如檢出率不高、假陽性率高、檢測通量低、實驗技術要求高、實驗時間較長、檢測成本高等，因此難以用于臨床檢測。微衛星多態性檢測新方法有侵入探針分析法和高分辨率熔解曲線分析法。侵入探針分析法是一種等溫的定性或定量檢測技術，操作簡單，但靈敏度較低[13]。高分辨率熔解曲線分析是一種高效穩定的PCR檢測技術，操作簡便快速，成本低，已廣泛應用于檢測單核苷酸多態性，但它檢測微衛星多態性分辨率不高[14]。

TaqMan探針技術已成為一種經典的定量PCR技術，特異度強，靈敏度高，既可用于定量分析，又可用于定性檢測[15]。TaqMan探針技術檢測關鍵在于合成探針及引物，這給檢測特定位點序列變異、微衛星多態性序列變異帶來困難。在中國人群中UGT1A1基因啟動子區A(TA)nTAA多態性序列包括A(TA)6TAA和A(TA)7TAA，用TaqMan探針技術區分它們需設計一對引物和兩條探針，且探針覆蓋A(TA)nTAA序列。本研究首先設計與A(TA)7TAA序列雜交的探針2：5′-TGC CAT ATA TAT ATA TAT ATA AGT AGG A-3′，為了使2條探針的退火基本一致，設計與A(TA)6TAA序列雜交的探針1時，本研究在探針的5′端延伸了一個T堿基，因此探針1為5′-FAM-TTG CCA TAT ATA TAT ATA TAA GTA GGA-MGB-3′。普通熒光定量PCR TaqMan探針的Tm一般需高于引物的Tm值10 ℃左右，若目標區域(A+T)%含量高，往往達不到10 ℃左右Tm差值的要求[16]。若延長探針長度，又難以區分A(TA)6TAA和A(TA)7TAA序列，3′ 端標記MGB可提高探針的Tm值，故本研究的探針3′ 端以MGB標記。兩條探針的5′ 端依據一般實進熒光定量PCR儀激發波長范圍分別標記熒光染料FAM與VIC。本研究關鍵在于成功設計了擴增UGT1A1基因啟動子區A(TA)nTAA多態性序列的探針及引物，并在探針3′端使用MGB修飾，使探針尤其適合檢測富含AT重復序列。目前臨床檢測病原性微生物的基因擴增技術基本都采用了實時熒光定量PCR技術，并且同一廠家的大多數試劑盒共用一個檢測程序，極大簡化了臨床檢測。本研究使用實時熒光定量PCR技術檢測A(TA)nTAA多態性，可與病原性微生物基因檢測同步進行，檢測方便，具有臨床應用價值。

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作者簡介：徐羽中，女，主管技師，主要從事分子診斷研究。 △通訊作者，E-mail：shunchangsun@aliyun.com。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.13.023

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)13-1806-03

(收稿日期：2016-01-27修回日期：2016-04-08)

Analysis on A(TA)nTAA polymorphism of UGT1A1 gene promoter by fluorescence real-time quantitative PCR

XUYuzhong1,CHENQunrong2，SUNShunchang1△，PENGYunsheng1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory;2.DepartmentofBloodTransfusion,BaoanDistrictPeople′sHospital,Shenzhen,Guangdong518101，China.)

Abstract:ObjectiveTo develop a new method to detect A(TA)nTAA polymorphism in the UGT1A1 gene promoter by fluorescence real-time quantitative PCR (RQ-PCR).MethodsGenomic DNA was extracted from peripheral blood in 16 patients with Gilbert′s syndrome and 66 healthy individuals.The polymorphic A(TA)nTAA sequence in the UGT1A1 gene promoter was determined by DNA sequencing.A pair of primers and two TaqMan probes labeled with either 5′ FAM or VIC reporter dye incorporated a 3′ minor groove binder were designed.The A(TA)nTAA polymorphisms in the UGT1A1 gene promoter were identified by RQ-PCR for all research subjects.The sensitivity and specificity of RQ-PCR for detecting the A(TA)nTAA polymorphisms were verified by DNA sequencing method.ResultsThe homozygous A(TA)7TAA polymorphism was found in the promoter region of the UGT1A1 gene in all 16 patients with Gilbert′s syndrome by using RQ-PCR.The homozygous A(TA)6TAA polymorphism was found in 46 healthy subjects,while the heterozygous A(TA)6TAA/A(TA)7TAA polymorphism was found in other 20 healthy subjects.All A(TA)nTAA polymorphisms in the promoter region of the UGT1A1 gene identified by RQ-PCR were consistent with that of DNA sequencing.ConclusionIt is a sensitive,specific and simple method to detect the A(TA)nTAA polymorphisms in the promoter region of the UGT1A1 gene by RQ-PCR,which can be promoted and applied in clinic.

Key words:UGT1A1 gene;polymorphism;fluorescence real-time quantitative PCR