Fe3O4納米粒子與慢病毒載體共同感染內皮祖細胞的促血管新生和MRI示蹤的應用

王　娟, 周　兵, 王欣欣, 吳秀娟, 厲　婷, 張文科, 劉亢丁

(1. 吉林大學第一醫院, 長春 130021; 2. 吉林大學化學學院物理化學系, 長春 130012;3. 超分子結構與化學國家重點實驗室, 吉林大學化學學院, 長春 130012)

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Fe3O4納米粒子與慢病毒載體共同感染內皮祖細胞的促血管新生和MRI示蹤的應用

王娟1, 周兵2, 王欣欣3, 吳秀娟1, 厲婷1, 張文科3, 劉亢丁1

(1. 吉林大學第一醫院, 長春 130021; 2. 吉林大學化學學院物理化學系, 長春 130012;3. 超分子結構與化學國家重點實驗室, 吉林大學化學學院, 長春 130012)

摘要采用化學共沉淀法制備了檸檬酸鈉修飾Fe3O4納米粒子(NPs), 使用胎牛血清(FBS)改善Fe3O4NPs的分散性. 實驗表明Fe3O4NPs尺寸均勻, 且具有良好的穩定性, FBS濃度小于5%(體積分數) 時, Fe3O4NPs無聚集沉淀; 在300 K下, 飽和磁化強度達到74.86×10-3A·m2/g(74.86 emu/g); 核磁共振T2序列成像時, 75 μg/mL Fe3O4NPs與慢病毒載體(LV)共同標記內皮祖細胞(EPCs)成像效果良好; 而且EPCs具有穩定過表達目的基因血管內皮生長因子(VEGF)的能力. 利用Fe3O4NPs與LV共同感染EPCs, 可有效促進大鼠血管生成. 說明修飾后的EPCs兼具核磁共振成像(MRI)示蹤和促血管生成雙重功能.

關鍵詞Fe3O4納米粒子; 內皮祖細胞; 慢病毒載體; 血管內皮生長因子; 磁共振成像

近年來, 磁共振對比成像技術與干細胞促進血管新生的基礎研究及應用發展迅猛, 但評價細胞植入及定位標記示蹤研究卻明顯滯后, 對細胞在活體內的功能評價具有局限性. 因此, 開發具有磁共振成像和促血管生成雙重功能的材料體系對促進組織血管新生, 實現活體器官靶向示蹤具有重要意義.

Fe3O4納米粒子(NPs)在室溫下表現出超順磁性, 是磁共振成像(MRI) T2序列造影劑. Fe3O4NPs粒徑小, 穿透力強, 弛豫率約為相同條件下Gd3+的7～10倍, 在水相中可以穩定分散[1～4]. 在生物化學領域中, Fe3O4NPs主要通過2種方式干預生物功能, 一種是通過活體細胞標記, 即NPs自身攜帶特異性抗體或多肽與細胞表面抗原結合或粒子通過細胞吞噬和胞飲方式進入細胞內; 另一種是通過NPs活體注射, 被網狀內皮系統特異性識別, 通常需要具有透膜能力的多肽或轉染試劑(如聚-L-賴氨酸、 精蛋白)的輔助作用來實現胞內標記[5～7], 再進一步MRI示蹤, 實現在生物體內的應用.

內皮祖細胞(EPCs)為成體干細胞, 成熟后為內皮細胞, 是脈管系統的重要組成部分, 直接促進新生血管形成及內皮細胞的修復, 或通過大量分泌血管內皮生長因子(VEGF)及胰島素樣生長因子等促進局部缺血組織的血管新生[8,9]. VEGF是高度特異性的血管多功能生長因子, 受體主要表達于內皮細胞, 具有促進血管新生和成熟, 維持血管正常狀態及完整性等作用[10～13]. 慢病毒載體(LV)是目前基因治療的主要載體, LV攜帶目的基因修飾后的EPCs可優化其血管新生能力, 促進細胞增殖分化[14].

本文利用檸檬酸鈉的羧基在磁性Fe3O4NPs表面形成配位鍵, 得到具有良好穩定性Fe3O4NPs, 經胎牛血清(FBS)進一步修飾, 改善Fe3O4NPs在水相中的分散性. 通過將Fe3O4NPs與LV室溫共孵育, 以非共價鍵結合形成復合物[15], 同時攜帶VEGF基因, 然后以細胞胞吞噬的方式進入細胞內部發揮作用, 實現目的基因VEGF的蛋白表達, 進一步促進血管生成和磁性NPs的動態示蹤雙重作用.

1實驗部分

1.1試劑與儀器

氯化鐵(FeCl3·6H2O)、 氯化亞鐵(FeCl2·4H2O)、 氨水(NH3·H2O)和檸檬酸鈉(C6H5Na3O7·2H2O)均為優級純, 購于 Sigma-Aldrich公司. 攜帶血管內皮生長因子(VEGF)和增強型綠色熒光蛋白(EGFP) 的HIV-1慢病毒載體, 內皮祖細胞(EPCs)參照文獻[16,17]方法合成. Anti-rat VEGF, CD34和β-actin抗體, 購于Abcam公司.

JEM-2100F型透射電鏡(TEM, 日本電子公司); VERTEX 80V型FTIR紅外分光光度計(Brucker公司); Nano Zetasizer 2000型動態光散射儀(Malvern公司); SQUID-VSM 磁性測量系統(美國量子設計公司); TrioTim 3.0 T核磁共振儀(德國西門子公司); BX53熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司).

1.2實驗過程

1.2.1磁性Fe3O4NPs的制備將1.655 g FeCl3·6H2O和1.050 g FeCl2·4H2O溶于40 mL除氧的去離子水中, 于室溫、 氮氣保護下攪拌, 完全溶解后, 加入5 mL 25.57 mol/L 氨水, 溶液立即由棕黃色變為黑色. 反應10 min后, 加入4.4 g 檸檬酸鈉, 升溫至90 ℃, 攪拌陳化30 min, 冷卻至室溫. 磁性分離Fe3O4NPs, 用去離子水清洗3次至溶液為中性, 同時去除多余的保護劑, 產物用去離子水重懸, 加入FBS(體積分數≤5%), 得到Fe3O4NPs溶液, 分散均勻, 于4 ℃冰箱恒溫保存.

1.2.2LV與不同濃度Fe3O4NPs感染EPCs觀察感染的EPCs治療大腦中動脈閉塞局灶性腦缺血(MCAO)模型的促血管生成效果. LV對EPCs的最適感染復數(MOI)值為50 IU, 分別與含Fe3O4NPs濃度為0, 2.5, 5, 10, 12.5, 25, 50, 75, 100和125 μg/mL的5%FBS分散液室溫共孵育30 min, 加入到EGM-2培養基(培養基內Polybrene終濃度為10 μg/mL)中, 混合物感染細胞融合達到60%的EPCs, 經37 ℃培養24 h后, 改用EGM-2全培養基. EPCs感染48 h后在熒光顯微鏡下觀察感染的EPCs的細胞狀態以及EGFP的表達情況; 收集感染72 h的EPCs, 用瓊脂糖固定EPCs懸液, 避免細胞沉降, 于MRI T2序列成像; 應用Western blotting方法對VEGF蛋白的過表達情況進行評價.

改良Zea Longa方法[18], 制備大鼠腦MCAO模型. MCAO模型建立24 h后, 尾靜脈注射上述感染的EPCs 2×106個/只, 以0.4 mg/mL多聚甲醛灌注大鼠心臟, 取腦, 石蠟包埋, 切片, 用免疫組化的方法, 進行CD34標記評價血管新生情況.

2結果與討論

2.1Fe3O4NPs的結構表征

圖1為Fe3O4NPs的透射電鏡照片. 采用化學共沉淀法制備得到分散均勻的球形Fe3O4[圖1(A)], 高分辨透射電鏡(HRTEM)照片中間距為0.297 nm的晶面對應于反尖晶石結構的Fe3O4NPs的(220)晶面 [圖1(B)]. 從圖2(A)可以看出, Fe3O4NPs的粒徑為(8.1±1.7) nm. 電子衍射圖[圖2(B)]中, 在0.302, 0.255, 0.2111, 0.163和0.151 nm處的衍射環對應Fe3O4的(220), (311), (400), (511), (440)晶面, 表明Fe3O4NPs為反尖晶石結構[19].

元素分析(EDS)結果表明, 合成的Fe3O4NPs中含有Fe元素; 紅外光譜(FTIR)圖(圖3)中1629和1402 cm-1處出現檸檬酸根上的羧基伸縮振動吸收峰, 檸檬酸根的羧基與Fe3O4NPs表面的鐵原子形成共軛作用[20]; 583 cm-1處為典型的Fe—O紅外特征吸收峰. 表明產物為檸檬酸根修飾的Fe3O4NPs.

2.2Fe3O4NPs的性能表征

動態光散射(DLS)測試檸檬酸鈉包覆的Fe3O4NPs在體積分數5%的FBS溶液中的粒徑大小及其分布, 結果表明粒徑主要分布在30～55 nm[圖4(A)], 比透射電子顯微鏡中NPs的粒徑統計結果(6～10 nm)明顯增大, 這主要是由于水溶液中存在顆粒水合作用, 因此DLS測試的是NPs的二次粒度[21,22].

檸檬酸鈉修飾的Fe3O4NPs在pH =7.0的FBS溶液中帶負電荷,Zeta電位主要分布在(-25.0±4.6) mV[圖4(B)], 這是由于蛋白大分子帶負電荷[23], 有利于Fe3O4NPs在FBS溶液中的穩定分散, 避免沉降導致的顆粒聚集. 通過振動樣品磁強計在300 K 下對Fe3O4NPs粉末進行磁響應性表征. 由磁滯回線[圖4(C)]可見檸檬酸鈉修飾Fe3O4NPs的飽和磁化強度達到74.86×10-3A·m2/g(74.86 emu/g), 即無剩磁, 也無矯頑力, 在室溫下呈超順磁性的特點. 國外同類商品化NPs如Ferumoxides的飽和磁化強度為63×10-3A·m2/g(63 emu/g), 而MR成像對比劑所要求的最低強度為41×10-3A·m2/g(41 emu/g)[24～26]. 本文制備的Fe3O4NPs的飽和磁化強度為74.86×10-3A·m2/g(74.86 emu/g), 故能滿足MRI成像的要求.

2.3FBS修飾后的Fe3O4NPs的穩定性

Fe3O4NPs濃度為3 mg/mL, FBS濃度為5%, 72 h內Fe3O4NPs均勻分散, 為LV與Fe3O4NPs共孵育提供穩定液態環境. 將3 mg/mL的Fe3O4NPs分散在5%FBS和H2O中, 靜置6個月, 可見在H2O中, NPs出現少量的聚沉, 而FBS溶液中未見明顯沉降(圖5), 這是由于FBS溶液中蛋白大分子攜帶負電荷利于NPs穩定分散, 并且FBS溶液中, 蛋白大分子結構中的—COOH可與納米粒子形成共軛作用[27].

2.4MRI檢測

不同濃度Fe3O4NPs 的FBS溶液與LV共感染EPCs, 各組經MRI掃描后在T2序列橫斷面成像, 結果示于圖6. 表明0, 2.5, 5, 10, 12.5, 25和50 μg/mL標記組T2信號強度依次減低, 75, 100和125 μg/mL標記組呈現較強的短T2低信號, 75 μg/mL標記組相對顯示效果較好. 影響MRI成像效果因素為Fe3O4NPs的粒徑、 外層包裹物的親水性和化學特性[28]. 共沉淀法制備檸檬酸鈉修飾的Fe3O4NPs經FBS處理, 改善了NPs的粒徑分布和親水性, 表現出良好的成像效果.

2.5攜帶VEGF的LV與Fe3O4NPs共同感染EPCs的熒光表達

攜帶VEGF的LV與Fe3O4NPs [LV(VEGF)-Fe3O4NPs]共同感染的EPCs經37 ℃培養48 h后, 慢病毒的EGFP在細胞內呈現綠色熒光表達, 200倍視野中EGFP呈陽性細胞可達70%左右(圖7), 表明感染后的EPCs有良好的熒光標記作用.

2.6LV與Fe3O4NPs共同感染EPCs的VEGF蛋白表達

用LV(VEGF)-Fe3O4NPs、 攜帶VEGF的病毒載體[LV(VEGF)]和空病毒載體(LV)分別感染EPCs, 提取蛋白Western blotting, 檢測VEGF的表達, 以β-actin為內參對照. LV(VEGF)-Fe3O4NPs, LV(VEGF)與LV組存在顯著差異(P<0.05)(圖8), 表明感染后的EPCs可顯著過表達VEGF蛋白.

2.7感染后的EPCs治療MCAO的促血管新生作用

采用免疫組織化學染色標記MCAO大鼠腦組織的CD34陽性細胞, 表示微血管密度(MVD), MVD計數按Weidener等[29]方法進行. 計算每平方毫米(mm2)面積內微血管的數量, 即MVD, 然后求其平均值. 結果顯示, 感染后的EPCs(EPCs-VEGF- Fe3O4NPs)治療組[圖9(A)]、 EPCs治療組[圖9(B)]和生理鹽水治療組[圖9(C)]間存在明顯差異(P<0.05). 在7 d時, EPCs-VEGF-Fe3O4NPs治療組、 EPCS治療組和生理鹽水治療組的MVD分別為(270.1±13.6), (214.2±17.3)和(157.4±11.7)個, 表明感染后的EPCs可使MCAO產生促血管新生作用.

3結論

采用化學共沉淀的方法, 以氯化鐵和氯化亞鐵為鐵源, 氨水為還原劑, 檸檬酸鈉作為保護劑, 制備了均一、 穩定的Fe3O4NPs. 通過FBS對Fe3O4NPs進一步修飾, 改善Fe3O4NPs在水相溶液中的分散性, 有利于與LV形成穩定的復合體后感染EPCs, 實現了EPCs中VEGF蛋白的穩定過表達, 對促進組織血管新生, 實現活體器官靶向示蹤具有重要意義.

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(Ed.: D, Z)

? Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81271294).

Preparation of Fe3O4Nanoparticles and Lentiviral Vector Infected EPCs for the Improvement of Angiogenesis and MRI Tracing?

WANG Juan1, ZHOU Bing2, WANG Xinxin3, WU Xiujuan1, LI Ting1,ZHANG Wenke3, LIU Kangding1*

(1.theFirstHospital,JilinUniversity,Changchun130021,China;2.DepartmentofPhysicalChemistry,CollegeofChemistry,3.StateKeyLaboratoryofSupramolecularStructureandMaterials,CollegeofChemistry,JilinUniversity,Changchun130012,China)

KeywordsFe3O4nanoparticles; Endothelial progenitor cell; Lentiviral vector; Vascular endothelial growth factor; Magnetic resonance imaging

AbstractFe3O4nanoparticles(NPs) modified with sodium citrate were preparedviachemical coprecipitation method and fetal bovine serum(FBS) could improve the dispersibility of Fe3O4NPs in FBS solution(volume fraction≤5%). At the temperature of 300 K, the saturation magnetization intensity of NPs reached 74.86×10-3A·m2/g(74.86 emu/g); MRI T2 imaging of endothelial progenitor cells(EPCs) became better after being infected by 75 μg/mL of Fe3O4NPs and lentiviral vectors(LV); furthermore, EPCs could stably over express VEGF target gene. EPCs co-infected with Fe3O4NPs and LV, after being injected into caudal vein of focal cerebral ischemia rats could effectively promote angiogenesis. These results indicated the modified EPCs possessed both MRI tracing and angiogenesis, and therefore had potential application value in clinical therapy of cerebral ischemia.

收稿日期:2016-03-25. 網絡出版日期: 2016-05-10.

基金項目：國家自然科學基金(批準號: 81271294)資助.

中圖分類號O631; O647

文獻標志碼A

聯系人簡介: 劉亢丁, 女, 博士, 教授, 主要從事神經病學腦血管病研究. E-mail: kangdingliu@163.com