蔓越橘植物性化學物質與亞鐵離子螯合作用對細菌生長的影響

嚴 帆，方平平，靳衛亞

(安徽師范大學花津校區，安徽蕪湖 241000)

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蔓越橘植物性化學物質與亞鐵離子螯合作用對細菌生長的影響

嚴 帆，方平平，靳衛亞

(安徽師范大學花津校區，安徽蕪湖 241000)

摘要[目的]探討蔓越橘汁中植物性化學物質與生長環境中亞鐵離子的螯合作用是否為蔓越橘汁抑菌的主要因素。[方法]采用革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌為對象，乙二胺四乙酸(EDTA)為參照物，利用平板涂布方法研究蔓越橘植物性化學物質與亞鐵離子螯合作用對細菌生長的影響。[結果]隨著亞鐵離子溶液濃度的提高，蔓越橘汁固相萃取物組金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長曲線相對低于EDTA組，甚至出現過量亞鐵離子抑制細菌生長的現象。[結論]蔓越橘汁的抑菌原理主要來源于植物性多酚物質對細菌的作用，而非間接的與亞鐵離子螯合作用。

關鍵詞蔓越橘；金黃色葡萄球菌；大腸桿菌；EDTA

Effects of Sequestration of Cranberry Phytochemicals and Iron Ion on the Growth of Bacteria

YAN Fan, FANG Ping-ping, JIN Wei-ya( Huajin Campus of Anhui Normal University, Wuhu, Anhui 241000)

Abstract[Objective] To determine whether sequestration of cranberry phytochemicals and iron ion was the main factor affecting the bacteriostasis of cranberry juice. [Method] With Gram-positive bacteriaStaphylococcusaureusand Gram-negative bacteriaEscherichiacolias the research materials and EDTA as reference substance, effects of sequestration of cranberry phytochemicals and iron ion on bacteria growth were researched by spread-plate method. [Result] With the increase of iron ion concentration, the growth speeds ofS.aureusandE.coliin solid phase extraction (SPE) of cranberry juice was lower than those in EDTA group; excessive iron ion even inhibited the growth of bacteria. [Conclusion] The main bacteriostasis mechanism of cranberry juice is the effects of plant polyphenols on bacteria, but not the sequestration with iron ion.

Key wordsCranberry;S.aureus;E.coli; EDTA

蔓越橘(Vacciniummacrocarpon)為杜鵑花科越橘屬常綠灌木，主要生長在北半球暖溫帶且土質為酸性泥炭土的山丘或平原中[1]。蔓越橘的營養成分種類多、含量高，并且果實中含有多種生物活性成分，具有多種保健功能。蔓越橘在保護視力、控制尿路感染、預防血栓和動脈硬化、維持正常血壓等方面具有較好效果[2]。關于蔓越橘能夠有效抑制細菌生長的研究常有報道[3-6]，但關于其抑菌機理的研究鮮有報道。為此，筆者以革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌為研究對象，探究了蔓越橘植物性化學物質與亞鐵離子螯合作用對細菌生長的影響，以期為蔓越橘汁的抑菌機理研究提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象。 蔓越橘汁(Ocean Spray，美國)于2014年3月通過郵寄方式從澳大利亞墨爾本當地超市購買。革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)純菌種(ATCC 25923)和革蘭氏陰性菌大腸桿菌(Escherichiacoli)純菌種(ATCC 25922)均取自安徽師范大學生命科學學院菌種保藏實驗室。

1.1.2主要試劑。營養肉湯(NB)、貝爾德帕克瓊脂(BPA)和胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(TSA)等均購自浙江杭州天和微生物試劑有限公司；C18固相萃取(SPE)柱購自愛爾蘭Waters公司。

1.1.3主要儀器。XFS-280A手提式壓力蒸汽滅菌鍋由浙江新豐醫療器械有限公司生產； SF-CJ-2B超凈工作臺由上海三發科學儀器有限公司生產； LHP-250恒溫培養箱由上海三發科學儀器有限公司生產；RE型旋轉蒸發儀由上海亞榮生化儀器廠生產。

1.2方法

1.2.1蔓越橘汁的濃縮。量取50.0 mL甲醇和100.0 mL蒸餾水潤洗SPE柱，過濾300.0 mL蔓越橘汁。過濾時，蔓越橘汁有機物質和糖分與酚類物質分離，酚類物質回收在100.0 mL甲醇溶液中，形成酚類物質甲醇洗脫液。酚類物質甲醇洗脫液用旋轉蒸發儀在55 ℃下蒸發至回收裝置中至不再有甲醇滴下為止，在室溫下用100.0 mL滅菌水溶解殘留物，得到總酚含量3倍濃縮的樣液。該樣液用10%氫氧化鈉溶液調節pH至中性，采用0.2 μm一次性針頭濾器膜過濾，4 ℃儲存備用。

1.2.2線性關系的考察。稱取(0.110±0.001) g沒食子酸(GA，相對分子質量188.14)，于100.0 mL容量瓶中溶解并定容，搖勻。用移液管分別移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL沒食子酸標準儲備溶液于100.0 mL容量瓶中，用水定容，搖勻，濃度分別為10、20、30、40、50、60 μg/mL。用移液管分別移取沒食子酸工作液、水及測試液各1.0 mL于刻度試管中，在每個試管中分別加入5.0 mL福林酚試劑，搖勻。反應5 min后，加入4.0 mL 7.5%碳酸鈉溶液，加水定容，搖勻。置于25 ℃恒溫水浴鍋中60 min，顯色后于765 nm波長下測定吸光度，繪制濃度與吸光度的標準曲線。

1.2.3培養基的配制。稱取NB干粉22.000 g，加入蒸餾水1 000.0 mL溶解，分裝8.0 mL NB溶液至透明試劑小瓶中，121 ℃高壓滅菌30 min，常溫冷卻后，4 ℃儲存備用。稱取BPA干粉58.000 g，加熱攪拌溶解于1 000.0 mL 蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌15 min，冷卻至50 ℃左右，于培養基中加入常溫解凍的卵黃亞碲酸鉀增菌劑50.0 mL 搖勻后傾入無菌平皿。使用前在冰箱貯存不超過48 h。稱取TSA干粉40.000 g，加熱攪拌溶解于1 000.0 mL蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌15 min，常溫冷卻后，4 ℃儲存備用。稱取氯化鈉9.000 g溶于1 000.0 mL蒸餾水中，分裝9.0 mL 生理鹽水溶液至透明試劑小瓶中，121 ℃高壓滅菌30 min，常溫冷卻后，4 ℃儲存備用。

1.2.4細菌活化。分別挑取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌放入滅菌后的NB小瓶中，搖勻，37 ℃恒溫培養24 h。對活化后的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進行梯度稀釋，計算原菌液濃度，再配制濃度為6 log cfu/mL的菌懸液備用。

1.2.5對照試驗。根據表1設置不同的對照試驗，包括：蔓越橘汁SPE和不同濃度的亞鐵離子(Fe2+)溶液對金黃色葡萄球菌生長的影響；蔓越橘汁SPE和不同濃度的亞鐵離子溶液對大腸桿菌生長的影響；EDTA和不同濃度的亞鐵離子溶液對金黃色葡萄球菌生長的影響；EDTA和不同濃度的亞鐵離子溶液對大腸桿菌生長的影響。每組分別在0、3.5、7、24 h進行細菌平板涂布試驗，37 ℃恒溫培養24~48 h。每個梯度做3個平行試驗。結果均以log cfu/mL為單位基數表示。

表1　蔓越橘汁與亞鐵離子濃度對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長影響的試驗設計

注：*10 μL在10 mL的體系中只占1/1 000，對體積的影響可忽略不計。

Note：* 10 μL was only 1/1 000 of the 10 mL system，the impacts of which could be neglected.

1.2.6數據處理。結果計為平均值±標準偏差。運用SPSS16.0軟件對數據進行方差分析(ANOVA)，計算LSD，分析樣品間差異顯著性。

2結果與分析

圖1　沒食子酸標準曲線Fig.1　Standard curve of garlic acid

2.1蔓越橘汁植物性總多酚含量測定結果經過SPE柱洗脫后，蔓越橘汁中糖、VC等極性分子被移除，經氫氧化鈉調節至pH中性后，蔓越橘汁SPE主要成分為植物性多酚。由圖1可知，沒食子酸濃度為1~6 μg/mL時，與吸光度成良好的線性關系，線性回歸方程為：y=0.167 7x+0.125 5，相關系數R2=0.999 4。采用福林酚法測得濃縮3倍后的蔓越橘汁SPE植物多酚含量為(967±1)μg GAE/mL，原蔓越橘汁植物總多酚含量為(293±1)μg GAE/mL，植物性總多酚回收率高達91%，測量結果與前人研究[7]相符合。

2.2蔓越橘汁SPE抑制細菌生長測定結果由圖2可知，與相應對照組對比，蔓越橘SPE抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長分別達0.847和1.087 log cfu/mL(P<0.05)。隨著亞鐵離子溶液濃度的增加，金黃色葡萄球菌的生長所有增加，但無顯著差異。CE2、CE3和CE4組中大腸桿菌生長曲線與金黃色葡萄球菌走勢趨同(P> 0.05)，但CE5并未達到預期增加大腸桿菌增長的效果，培養24 h后反而比CE4降低了0.430 log cfu/mL。

2.3EDTA抑制細菌生長測定結果與相應對照組對比，10 mmol/L EDTA 溶液抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長分別達1.403和1.229 log cfu/mL(P<0.05)。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌活菌數隨著亞鐵離子溶液濃度的增加而顯著增加，1 mmol/L 亞鐵離子處理組與對照組菌落數接近(P>0.05)，2 mmol/L 亞鐵離子處理組比對照組分別增加了0.211和0.169 log cfu/mL(圖3)。

注：A.金黃色葡萄球菌；B.大腸桿菌。Note：A.S.aureus; B.E.coli.圖2　蔓越橘SPE和不同濃度亞鐵離子溶液對細菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長的影響Fig.2　Effects of cranberry SPE and Fe2+ concentration on the growth of S.aureus and E.coli

注：A.金黃色葡萄球菌；B.大腸桿菌。Note：A.S.aureus; B.E.coli.圖3　EDTA和不同濃度亞鐵離子溶液對細菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長的影響Fig.3　Effects of EDTA and Fe2+ concentration on the growth of S.aureus and E.coli

3結論與討論

3.1結論蔓越橘汁的抑菌原理主要來源于植物性多酚物質對細菌的作用，而非間接的與亞鐵離子螯合作用。

3.2討論在有氧生長條件下，鐵離子在多數細菌生長過程中起重要作用[8]，也是滅菌過程中的一種重要限制營養素[9]。蔓越橘汁中植物性總多酚物質包含黃酮類、原花青素和花青素，它們都含有1個或多個能夠和亞鐵離子發生強烈螯合作用的鄰位雙羥基多酚氫氧化基團[8，10]。因此，多酚物質與亞鐵離子的螯合作用可能是抑制細菌生長的原理被假設[10-12]。蔓越橘汁中有的多酚物質含有不止1個可以與鐵離子發生螯合作用的基團，這些基團可能與鐵離子發生螯合作用從而導致細菌生長過程中鐵離子不足，發生抑制細菌生長的現象。該研究表明，蔓越橘汁植物性多酚物質可有效抑制革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性大腸桿菌，與其他文獻數據類似[3，7-8]。

鐵離子缺乏情況下，細菌可產生4種在周圍環境中尋找鐵離子的鐵載體。然而，強效的鐵離子螯合劑EDTA加入細菌的生長環境中，迅速吸收亞鐵離子，從而導致細菌生長環境鐵離子缺乏產生抑菌現象[7]。該研究表明，加入過量亞鐵離子后，細菌菌落數有回升跡象，表明EDTA與亞鐵離子螯合作用是抑制細菌生長的主要機理。

該研究還發現，隨著亞鐵離子溶液濃度的提高，加入蔓越橘汁SPE組的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長曲線并不如EDTA組中生長迅速，甚至出現過量亞鐵離子抑制細菌生長的現象。已有文獻證明，多酚物質可以引起革蘭氏陰性細菌外細胞膜局部瓦解，導致細胞質外滲死亡[9，13]；多酚物質進入細菌菌體內，與DNA物質相互作用導致細菌死亡等[14]。因此，蔓越橘汁的抑菌原理主要來源于植物性多酚物質對細菌的作用，而非間接的與亞鐵離子螯合作用。

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收稿日期2015-12-24

作者簡介嚴帆(1988- )，女，安徽蕪湖人，講師，碩士，從事食品微生物、食品化學研究。

基金項目安徽師范大學青年教師科研專項(721355)。

中圖分類號S 666.2

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)03-019-03