基于樹枝狀分子及功能化金納米粒子的電化學免疫傳感器檢測污泥中大腸桿菌

魯文杰+張新愛+李昌烽+申建忠+蔣玉香+黃陳勇

摘要 利用樹枝狀分子-金納米粒子復合物修飾電極和金納米粒子標記物構建電化學免疫傳感器，用于污泥中大腸桿菌的檢測。首先在玻碳電極表面電聚合對氨基苯甲酸，通過共價作用結合第Ⅳ代氨基末端的樹枝狀分子（G4-PAMAM），并在其內部載入金納米粒子，制備修飾電極（GCE/p-ABA/PAMAM（AuNPs）），用于固定大腸桿菌。采用硫堇作為電活性物質包被金納米粒子，用于標記二抗制備金納米粒子標記物（Ab2-Au-Th）。通過抗原-抗體之間的特異性識別作用，將一抗、金納米粒子標記物依次修飾在電極表面，用差分脈沖伏安法測定硫堇產生的電流信號，實現對大腸桿菌的檢測。在優化的實驗條件下，響應電流與大腸桿菌濃度的對數在1.0×102～1.0×106 cfu/mL范圍內呈線性關系，檢出限為70 cfu/mL（S/N=3）。利用本方法檢測污水處理廠的不同污泥樣品中的大腸桿菌，回收率為89.4%～105.8%。

關鍵詞 城市污泥； 大腸桿菌； 樹枝狀分子； 功能化金納米粒子； 電化學免疫傳感

2016-01-10收稿；2016-04-11接受

本文系國家自然科學基金項目（Nos. 21205051， 11072091）和教育部科學技術重點研究項目（No.210078）資助

E-mail： zhangxinai@mail.ujs.edu.cn； cfli@ujs.edu.cn

1 引 言

隨著我國城市污水處理進程的全面推進，污泥的產量與日俱增，給自然環境帶來了沉重負擔。因此，污泥的合理回收利用顯得尤為重要[1，2]。然而，城市污泥成分復雜、微生物含量高，如果處置不當極易造成二次污染，特別是含有的病源微生物嚴重制約了污泥的有效利用[3～5]。污泥中病源微生物的危害與大腸桿菌（E. coli）的數量呈現一定的相關性[6]，因此大腸桿菌已經成為評估污泥回收利用可行性的重要指標，并被列為污泥微生物標準的必檢項目。目前，大腸桿菌的常規檢測方法主要有多管發酵法、濾膜法、稀釋平板計數法等[7～9]，但存在著耗時長、靈敏度低、操作繁瑣等缺點，不能滿足大腸桿菌快速檢測的需求。因此，建立污泥中大腸桿菌的快速、靈敏、準確的檢測方法， 對評估污泥綜合利用的可行性具有重要的現實意義。

電化學免疫傳感器具有靈敏度高、選擇性好、響應速度快和操作簡單等優點，在大腸桿菌檢測中呈現出良好的應用前景[10，11]。在電化學傳感器制備中，如何提高電極的導電性能和增大電活性物質的固載量，從而實現信號放大是關鍵[12～16]。樹枝狀分子由于其特殊的結構能夠封裝金屬絡合物、金屬納米粒子或有機和無機的客體分子而備受關注[17～20]。其中，樹枝狀分子-金納米粒子復合物兼具樹枝狀分子的表面活性和金納米粒子獨特的物理化學性質，既能增強樹枝狀分子的導電性，又能有效控制金納米粒子的尺寸。本研究基于雙重信號放大策略，利用樹枝狀分子-金納米粒子復合物修飾電極和硫堇包被金納米粒子標記二抗構建電化學免疫傳感器，用于污泥中大腸桿菌的測定，為污泥中大腸桿菌的檢測研究提供了新思路。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

CHI 660d 型電化學工作站（上海辰華儀器公司），采用三電極體系：以玻碳電極（GCE，Φ=3 mm）為基底的免疫傳感器為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對電極； JEM-2100透射電子顯微鏡（日本JEOL公司）； Cary 500紫外-可見分光光度計（美國Agilent公司）； Nicolet Nexus 670傅立葉紅外光譜儀（美國Thermo Nicolet公司）。

G4-PAMAM樹枝狀分子、硫堇（Th）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、牛血清白蛋白（BSA）購于Sigma-Aldrich 公司； 氯金酸（HAuCl4·3H2O）、硼氫化鈉（NaBH4）、對氨基苯甲酸（p-ABA）、戊二醛（GA）購于國藥集團化學試劑公司。兔抗大腸桿菌（DH5α）多克隆抗體（一抗，Ab1）、羊抗兔IgG（二抗，Ab2）由北京寶賽生物科技有限公司提供。10 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液（PBS，pH 7.4），含136.7 mmol/L NaCl，2.70 mmol/L KCl。大腸桿菌菌種（DH5α）由江蘇大學食品與生物工程學院提供。所用試劑均為分析純，實驗用水為超純水（>18.2 MΩ·cm）。所有玻璃容器在使用前均高壓滅菌消毒。污泥實際樣品取自于鎮江市某污水處理廠。

2.2 Ab2-Au-Th標記物的制備

采用檸檬酸鈉還原氯金酸制備金納米粒子（AuNPs）[21，22]。將30 mL金納米粒子溶液與6.0 mL飽和硫堇水溶液混勻，室溫下攪拌24 h， 15000 r/min離心10 min，得到硫堇包被金納米粒子沉淀（Au-Th）[23]； 用超純水清洗沉淀，分散于4 mL PBS中。加入50 μL 二抗，在攪拌條件下孵育4 h，制得Ab2-Au-Th標記物。5000 r/min離心12 min，棄去未結合的檢測抗體和副產物，用PBS重懸Ab2-Au-Th，于4℃保存備用。Ab2-Au-Th標記物的制備過程如圖1（底部）所示。

2.3 免疫傳感器的制備以及大腸桿菌的固定

玻碳電極用Al2O3拋光至鏡面，依次用丙酮、1.0 mol/L HNO3、1.0 mol/L NaOH及超純水超聲清洗5 min。將電極用氮氣吹干，放入5 mmol/L p-ABA溶液中，以50 mV/s掃速，在0～1.0 V間循環伏安掃描15圈，使電極表面羧基化，得到修飾電極（GCE/p-ABA）。清洗電極后，滴加10 μL含有EDC/NHS（400 mmol/L/100 mmol/L）的PBS溶液活化電極表面60 min。然后，在電極表面滴加10 μL PAMAM，使其氨基與電極表面的羧基反應60 min，制得GCE/p-ABA/PAMAM。將電極用二次蒸餾水清洗并吹干后，插入100 μL 0.1 mmol/L HAuCl4溶液中靜置60 min后，取出并用二次蒸餾水清洗除去多余的HAuCl4。將修飾電極浸入新配制的1.0 mol/L NaBH4溶液中放置30 min，取出用二次蒸餾水清洗，制得GCE/p-ABA/PAMAM（AuNPs）。滴加10 μL 0.25%GA溶液活化電極表面60 min，然后將修飾電極插入一定濃度的大腸桿菌溶液，37℃培養60 min，制備GCE/p-ABA/PAMAM（AuNPs）/E. coli。在電極表面滴加10 μL 1% BSA孵育30 min用于封閉活性位點。將修飾電極用PBS清洗并吹干后，滴涂10 μL Ab1，37℃條件下孵育60 min。然后將10 μL Ab2-Au-Th滴涂于電極表面，孵育60 min，用PBS清洗后，進行電化學檢測。

2.4 電化學檢測

修飾電極的制備過程采用電化學交流阻抗（EIS）進行表征：應用電位0.20 V，振幅0.05 V，頻率為0.10～100 kHz，靜置時間2 s。

大腸桿菌的測定采用差分脈沖伏安（DPV）法，在乙酸緩沖液中進行，電位掃描范圍為0～ 0.70 V，掃描速度50 mV/s，振幅0.05 V。通過測定電極表面固定的硫堇的響應電流實現對大腸桿菌的檢測。所有測定均在室溫下進行。免疫傳感器的制備及大腸桿菌的檢測過程如圖1所示。

3 結果與討論

3.1 Ab2-Au-Th標記物的表征

金納米粒子從透射電鏡（TEM）可見，金納米粒子（圖2A）呈球形，大小均勻，平均粒徑為20 nm。包被硫堇后，金納米粒子的粒徑變大， 且呈現小的團簇（圖2B），這是由硫堇的正電荷和金納米粒子表面的負電荷相互作用引起的。從圖2C的紫外-可見吸收光譜可見，金納米粒子在520 nm處呈現明顯的吸收峰（曲線a），硫堇在598和565 nm處有兩個吸收峰，分別是硫堇單聚體和二聚體的特征峰（曲線b

）。當硫堇包被金納米粒子后，由于硫堇分子之間強的電子耦合效應，565 nm處的吸收峰略微藍移（曲線c）。當硫堇包被金納米粒子并固載抗體后， 283 nm處的吸收峰發生紅移（曲線d），這是由于硫堇的吸收峰與抗體的吸收峰相互重疊造成的。

3.2 樹枝狀分子固載金納米粒子前后的紅外光譜表征

圖3是樹枝狀分子和樹枝狀分子固載金納米粒子的紅外光譜圖。由譜線a可見，樹枝狀分子紅外吸收中有明顯的酰胺I帶和酰胺II帶，分別位于1640 和 1558 cm1處。譜線b與譜線a相比，酰胺I帶和酰胺II帶均分裂成雙譜帶，表明金納米粒子的存在對酰胺鍵有明顯干擾，證明金納米粒子已成功載入樹枝狀分子 [24～27]。

3.3 不同修飾電極的電化學阻抗行為

以Fe（CN）3 6為氧化還原探針，采用交流阻抗法（EIS）考察工作電極界面的變化，如圖4所示，其中高頻部分的半圓直徑對應于電子傳遞阻抗（Rct）。裸玻碳電極的Rct值約為180 Ω（曲線a）； 電聚合對氨基苯甲酸后， Rct值變大，表明對氨基苯甲酸成功修飾到電極表面并阻礙電子傳遞（曲線b）； 從曲線c可以看出，樹枝狀分子修飾電極后，電極Rct值明顯下降，這可能是由于修飾在電極表面的氨基對溶液中Fe（CN）3 6產生一定的靜電吸附，加快了電子轉移速度所致； 當金納米粒子載入樹枝狀分子形成GCE/p-ABA/PAMAM（AuNPs）后， Rct值進一步降低，這是由于金納米粒子大大增加了電極的導電性（曲線d）； 當大腸桿菌結合在電極表面后，由于大腸桿菌作為非導電性物質阻礙了電子的傳遞，Rct值明顯增大（曲線e）； 依次修飾一抗與Ab2-Au-Th，Rct值逐步增大（曲線f和g）。

3.4 大腸桿菌測定條件的優化

考察了免疫反應時間對電流信號的影響，結果表明，隨著免疫反應時間的增加，電流信號逐漸增強，60 min時趨于穩定，因此選擇60 min作為免疫反應時間?？疾炝嗣庖叻磻獪囟仍?0～45℃范圍高于37℃，信號開始下降，這可能是因為在高溫時生物分子的活性降低，因此選擇37℃作為免疫反應的溫度。

3.5 免疫傳感器的性能比較

分別采用GCE/p-ABA/PAMAM和GCE/p-ABA/PAMAM（AuNPs）為基底的電化學免疫傳感器，用于檢測大腸桿菌（1.0×106 cfu/mL）。從圖5可見，GCE/p-ABA/PAMAM（AuNPs）為基底的免疫傳感器的檢測電流信號（曲線b）明顯高于GCE/p-ABA/PAMAM為基底的免疫傳感器的電流信號（曲線a），這是因為GCE/p-ABA/PAMAM（AuNPs）具有較大的比表面積和優良的電化學性能，既增加了大腸桿菌的固載量，又提高了電子的轉移速度。

3.6 傳感器的標準曲線及檢出限

在優化的實驗條件下，采用本方法檢測不同濃度的大腸桿菌標準溶液。圖6是DPV響應電流隨大腸桿菌濃度的變化圖。響應電流與大腸桿菌濃度的對數在1.0×102～1.0×106 cfu/mL范圍內呈線性關系（圖6插圖），線性回歸方程為Y（μA）= 0.1022+0.6144lgX（cfu/mL）（R2=0.9860， n=5），檢出限為70 cfu/mL（S/N=3）。

3.7 傳感器的特異性和重現性研究

污泥中其它微生物，如枯草桿菌、放線菌和酵母菌等， 對大腸桿菌的測定可能產生影響。1.0×104 cfu/mL大腸桿菌產生的響應電流信號為2.45 μA； 在該大腸桿菌溶液中分別加入1.0×104 cfu/mL枯草桿菌、放線菌和酵母菌，檢測大腸桿菌產生的響應電流信號分別為2.38， 2.52 和2.49 μA，電流的偏差分別為2.68%， 2.68%， 1.63%，表明其它微生物的存在對大腸桿菌的測定無明顯影響，證明傳感器具有較高的特異性。

對4個濃度的大腸桿菌（1.0×102，5.0×102，1.0×103和5.0×103 cfu/mL）分別測定5次，所測得濃度的批內相對標準偏差（RSD）為6.2%，5.8%，7.0%和6.5%，批間RSD為4.9%，6.8%，5.4%和7.2%，表明本方法具有較好的重現性。

3.8 樣品分析

對污水處理廠3個不同工序的污泥進行取樣，采用本方法進行大腸桿菌檢測，結果如表1所示。本方法與平板計數法[28]的相對誤差在±8%以內，回收率為89.4%～105.8%，表明建立的電化學免疫分析方法用于污水處理廠實際樣品中大腸桿菌的檢測具有可靠性好、準確度高等優點。與文獻[2，8～11]相比，本方法采用樹枝狀分子-金納米粒子復合物來實現信號放大，為污泥中大腸桿菌的檢測提供了新的思路。

4 結 論

利用樹枝狀分子-金納米粒子復合物修飾電極和硫堇包被金納米粒子標記抗體構建了一種用于污泥中大腸桿菌檢測的電化學免疫傳感器。樹枝狀分子和金納米粒子提高了電極的導電性能，增大了電活性物質的固載量，從而實現信號放大。與常規的大腸桿菌檢測方法相比，本傳感器具有檢測時間短、靈敏度高、選擇性好的特點。污水處理廠實際樣品的加標回收實驗結果表明，本方法具有較好的應用前景。

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Abstract A novel electrochemical immunosensor was developed for detection of E. coli in urban sludge based on dendrimer-encapsulated Au and enhanced gold nanoparticle labels. p-Aminobenzoic acid （p-ABA） was electropolymerized on glassy carbon electrode （GCE） surface to introduce abundant carboxyl groups. G4-polyamidoamine dendrimers （PAMAM） were covalently attached onto electrode surface through the formation of amide bonds between amino groups of dendrimer and carboxyl groups of poly-p-ABA. Subsequently， Au ions were coordinated in the interior of dendrimer and then reduced to form gold nanoparticles （AuNPs）. The resulting electrode （GCE/p-ABA/PAMAM（AuNPs）） provided numerous amino groups to allow highly dense immobilization of E. coli， and facilitated the improvement of electrochemical responses. The rabbit anti-E. coli polyclonal antibody （Ab1） was captured by the electrode surface-confined E. coli， followed by the attachment of the enhanced gold nanoparticle labels （Ab2-Au-Th） featuring thionine （Th） as signal-generating molecule. The analysis of E. coli was performed by electrochemical detection of Th in the bound labels on the electrode surface. Under the optimal experimental conditions， a linear relationship between the peak current of Th and the logarithmic value of E. coli concentration ranging from 1.0×102 cfu/mL to 1.0×106 cfu/mL was obtained with a detection limit of 70 cfu/mL （S/N=3）. The proposed strategy was also used to determine E. coli in samples obtained from waste water treatment plant， and the recoveries of standard additions were in the range of 89.4% to 105.8%. The results confirmed that the electrochemical immunoassay gave a useful protocol for E. coli analysis with high sensitivity， specificity and acceptable accuracy， and thus could potentially become a promising technique for estimating the feasibility of sludge recycling.

Keywords Urban sludge； E. coli； Dendrimer； Functionalized gold nanoparticle labels； Electrochemical immunosensing